邵志华，李 姣，许 洁，贾 松，沙继宏，吕立夏，徐 磊，李思光

（同济大学医学院a.细胞生物学系；b.医学与生命科学实验教学中心；c.生物化学与分子生物学系，上海 200092）

0 引言

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种多功能、高通量、高效的生物检测技术，其在科研和医学领域的作用越来越凸显。根据细胞内和细胞表面的标志物不同，FCM能够精确、快速地对细胞进行分析和分选［1］。FCM被广泛应用于疾病诊断、细胞治疗和药物研发等医学领域，已成为医学检验、诊断和科研的重要手段［2-4］。因此，在医学院校开展FCM的实验教学，对提高医学生的前沿知识水平和实验技能具有重要意义。自2004 年北京大学首次开展FCM的实验教学以来［5］，国内外多所大学先后对本科生进行了FCM实验教学的尝试，取得了比较满意的效果［6-9］。为了适应科技发展的需要，提高学校的实验教学水平，我校医学院开展了FCM的实验教学。

组织干细胞是存在于胎儿和成人各种组织和器官中的一类细胞，具有自我更新和分化潜能，异质性是组织干细胞的主要特征之一［10］。骨髓基质干细胞是存在于骨髓中的异质性细胞群，其中多能成体祖细胞（Multipotent adult progenitor cells，MAPCs）和间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是骨髓基质中两种主要的非造血干细胞，它们均可在体外增殖和分化，在疾病的移植治疗方面有着巨大的应用潜力，如神经退行性疾病的再生治疗。对骨髓基质干细胞的培养和分化研究证实，二者在形态、表面标志物和分化能力方面存在较大差异。MAPCs 的干性较强，可以分化为3个胚层的细胞，在年轻的骨髓中含量较高，主要为小三角形细胞，高表达CD90、OCT4、Nanog，低表达CD105、CD73、CD44、CD54 和HLA-ABC［11］；而MSCs的干性较局限，可以向中胚层和神经外胚层分化，是大梭形细胞，高表达CD90、CD105、CD73、CD44、CD54、CD29 和HLA-ABC［12］。因此，准确掌握干细胞的生物学特性对干细胞的临床应用具有重要意义。

自2015 年以来，我校一直为临床医学本科生开展精品实验项目——“大鼠骨髓基质干细胞的培养与分化”［13］，细胞培养结果稳定。但是，由于条件限制，未能进行细胞鉴定和亚群分析。近年来，医学与生命科学实验教学中心购置了一台分析型流式细胞仪（FACSVerse，BD），这为开设流式细胞术的教学提供了条件。采用大鼠骨髓来源的干细胞为材料，选用表面标志蛋白CD105 和CD90 对骨髓基质干细胞进行亚群分析，目的是在进行流式细胞术教学的同时，加深学生对干细胞特性的理解。

1 实验对象与方法

1.1 教学内容和教学方法

实验教学内容包括理论知识、实验操作和数据分析。理论知识包括流式细胞仪的工作原理和组成、荧光素的发光原理；操作技能包括流式样本的处理、实验设计、染色方法；数据分析包括流式软件的使用、数据处理、流式图的解释和分析。

以2018 级临床医学专业二年级本科生（22 人）为研究对象。采用翻转课堂教学法。第1 次课前，学生自主学习骨髓基质细胞原代培养的原理（微课视频），熟悉实验操作过程（JOVE 视频和PDF 文档），绘制实验流程图，完成课前测试；教师收集学生的不明问题。课中，在教师的引导下对不明问题进行讨论，教师讲解难点，梳理实验流程，最后学生分组实验操作。课后，学生分组进行细胞换液和传代，做好实验记录。第2次课前，学生自主学习流式相关知识，包括原理、仪器的组成和应用范围等（univ流式课堂），学习FlowJo软件的使用和流式结果分析（univ 流式课堂）、绘制实验流程图。同样，课中在教师的引导下对不明问题进行讨论，教师讲解难点，梳理实验流程，学生分组实验操作，最后老师演示上机，导出原始数据，学生使用FlowJo软件独立分析数据，教师随时解答学生的不明问题。课后，学生撰写实验记录并完成课后测试。最后以测试、实验流程图和实验记录的完成情况作为考核内容进行考核。

1.2 实验过程

实验分2 次进行。第1 次进行骨髓基质细胞的原代培养，第2 次进行抗体标记和流式分析。原代培养和抗体标记由学生课内分组（每组2 人）进行操作，每组1 只3 周龄SD大鼠。换液和传代由学生利用课外时间在教师的指导下分组完成。流式分析由教师演示，导出原始数据后，学生根据视频利用FlowJo 软件进行数据分析。实验具体步骤如下：

（1）骨髓基质细胞的原代培养。解剖股骨，分离骨髓基质细胞，接种于6 孔板中（3 个复孔），培养基为L-DMEM +双抗+10%FBS。2 天后更换培养液，弃掉未贴壁细胞。以后每3 天换液1 次，6～7 天传代。

（2）抗体标记。7 天后，骨髓基质细胞约80%汇合，弃上清，PBS 清洗后，用0.05%胰酶消化分离细胞。分别将细胞悬液转移到1.5 mL 离心管中。实验组加入CD105-488（1∶40）和CD90-APC（1∶300）；同型对照组加入Isotype Control-488（1 ∶40）和Isotype Control-APC（1∶300）；空白组加入抗体稀释液。4 ℃避光孵育1 h。流式缓冲液清洗过滤后将细胞转入流式管中。

（3）数据采集。教师示范开机、上样、设门和导出数据。

（4）数据分析。根据视频，每位学生自行安装FlowJo软件，并使用软件独立分析数据，包括数据导入、设门、分析结果，结果导出等。

1.3 教学评价

通过测试成绩和自评问卷进行评价。测试内容为流式相关知识，包括单选题和多选题。成绩采用课前测试成绩和课后测试成绩。对流式细胞术的熟练程度进行5 级评分。问卷通过问卷星发放，共收回有效问卷22 份，回收率100.00%（22/22）。

1.4 统计学处理

采用SPSS26.0 进行t检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 实验结果重现性好

实验采用骨髓基质干细胞为实验材料，取材方便，容易操作，细胞增殖快，每组（100%）均可获得稳定的结果（见图1、2）。原代培养可见小三角形和大梭形细胞。流式分析显示，SD 大鼠骨髓基质干细胞中MAPCs 细胞（CD90+/CD105-）的比例较高，为35.5%；MSCs 细胞（CD90+/CD105+）含量较少，为22.9%。

图1 骨髓基质细胞原代培养显微照片

图2 骨髓基质干细胞流式分析

2.2 促进了学生对干细胞特性的理解

流式分析结果显示，SD大鼠骨髓基质干细胞并不是单一的细胞群，由CD90+/CD105-（35.5%）、（15.6%）三个亚群组成。100%的学生认为本实验促进了他们对干细胞特性的理解，加深了学习的深度。

2.3 提高了学生的成绩和流式技能

对流式相关知识的课前和课后测试结果显示（见图3），课后测试的平均成绩［（81.76 ±11.85）分］明显高于课前［（44.12 ±16.22）分］，差异有统计学意义（P＜0.05）。课后单选题［（45.88 ±5.07）分］和多选题［（35.88 ± 10.64）分］的平均成绩均高于课前［（33.53 ±13.67）分和（10.59 ±8.99）分］，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，多选题的分数提高明显。对流式技能的自评分析显示（见表1），学生已基本熟练掌握流式工作原理（4.06 ±0.90）、操作流程（4.18±1.07）、对照设计（4.06 ±1.14）、软件的使用（4.29±0.92）和结果解释（4.12 ±1.05）。然而，对荧光染料的选择（3.94 ±1.14）尚未达到熟练水平，提示需要加强此内容的教学。

图3 实验组课前和课后测试成绩比较

表1 学生对学习效果自评（，分）

表1 学生对学习效果自评（，分）

3 实验教学讨论

目前，国内外已经有多所院校为不同层次的医学生开展了流式细胞术的实验教学。在以本科生为教学对象的实验教学中，通常以微生物、细胞系和免疫细胞为实验材料［6，9，14-16，］。如2019 年，White 等［9］以金黄色葡萄球菌为材料，开展了流式细胞术检测细菌膜电位的教学；2014 年，Ott 等［14］以HEK293 细胞系为材料，开展了流式细胞术检测转染效率的教学；2018 年，黄国虹等［16］进行了T 淋巴细胞亚群的检测的教学。骨髓基质干细胞是一类具有自我更新及分化潜能的细胞，因其巨大的实用价值，已经成为世界医学研究的热点。自2015年以来，本校已经为二年级的本科生开展了骨髓基质干细胞的培养实验［13］，实践证明骨髓基质干细胞取材方便、培养成功率高，适合低年级的本科生操作。结合研究热点和自身的基础，本实验采用骨髓基质干细胞为材料进行流式细胞术的教学。结果证明，实验效果稳定，100%的学生可获得满意的结果。学生认为实验促进了他们对干细胞特性的理解，加深了学习的深度。

在教学内容上，国内的流式细胞术教学主要以仪器的原理、实验操作和仪器演示为主；而国外的教学除了基本理论和实验操作外，还会安排软件使用和实验设计的内容。如2004 年，Boothby 等［17］让学生在完成基本理论学习的基础上，提出问题、设计实验，然后分组验证实验、采集并分析数据。学生们认为教学提高了他们的分析数据和对科研课题的理解能力。2016年，Fuller等［18］在学生完成流式基本理论学习后，设计了FlowJo软件的互动教学，他们为学生提供原始的流式数据，要求每位学生独立分析数据。他们的研究证明将复杂的数据分析任务纳入课堂，有益于学生理解和掌握复杂的概念，提高学生的自信。本实验在完成基础理论学习和实验操作的基础上，设计了FlowJo 流式软件的实践环节，包括软件安装、数据导入、设门、分析结果，结果导出等。学生反映，本实验提高了他们的流式实验技能。自评分析显示学生已经熟练掌握软件的使用（4.29 ±0.92）和解释结果（4.12 ±1.05）。然而，由于仪器数量的限制，数据采集仅进行了示范教学，学生未能进行上机操作。

在教学方法上，采用了翻转课堂教学，课前学生自主学习并完成前测，课上在教师的帮助下解决难点和困难、完成实验操作，课后完成实验记录和后测。多项研究显示［19-21］，翻转课堂能提高学生的积极性和满意度、加深学习的广度和深度。研究显示，学生课后测试的平均成绩［（81.76 ± 11.85）分］明显高于课前［（44.12 ± 16.22）分］，其中多选题的平均成绩［（35.88 ±10.64）分］显著高于课前［（10.59 ±8.99）分］。自评结果显示学生熟练掌握流式工作原理（4.06 ±0.90）、操作流程（4.18 ±1.07）、对照设计（4.06 ±1.14）。然而，学生对荧光染料选择（3.94 ±1.14）自评分数较低，这是因为荧光抗体是由教师选择并订购，未让学生参与，导致学生对这个实验环节掌握不足。

4 结语

在精品实验项目——“大鼠骨髓基质干细胞的培养与分化”基础上，将干细胞培养与流式细胞术相结合，建立了以骨髓基质干细胞为材料的流式分析实验。实验采用翻转课堂教学法，注重理论知识、实验操作、软件使用和数据分析多种能力的培养。自2018 年以来的教学实践证明实验容易操作，效果稳定，获得了学生的认可，适合为本科生开展。以骨髓基质干细胞为材料的流式分析实验提高了学生的前沿知识水平和实验技能，优化了实验项目，提升了本校的实验教学水平。