蒋海霞，罗 倩，许 杰，施 敏，张 萍1，b

（上海交通大学a.生命科学技术学院；b.生命科学与技术国家级实验教学示范中心，上海 200240；2.贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司生命科学事业部，上海 200335）

0 引言

高校大型仪器设备是提高科研水平，提升实验教学质量、培养高素质人才的重要保障［1-2］。近年来，高校越来越重视本科生的科研能力培养。生物学的快速发展离不开检测仪器的支持，然而生物学实验课程往往在教学内容中以理论教学代替大型贵重仪器的实践教学。因此，有必要对传统的生物学实验教学进行一些探索性的实践，以推动生物学实验教学改革。

1 高校大型仪器平台的机遇和挑战

1.1 高校大型仪器平台的机遇

近年来，随着我国高等院校的迅猛发展，高校学科建设日益增强，科研力量不断壮大，各学院仪器共享平台在多种学科建设经费和科研经费的支持下，购置了多种大型仪器和设备。据统计，自2008 年以来，大部分高校的大型仪器设备的年增幅都在14%以上［3-4］。大型仪器平台为学科发展和科研工作提供仪器和相应的技术服务支撑，已经成为国家、高校和科研部门科技创新的“航空母舰”。

我校生命科学技术学院仪器共享与技术服务平台以微生物代谢国家重点实验室为载体，整合了学院优势资源，拥有各类仪器180 余台（套），共计价值1.5亿元；是校内大生命科学平台中建设最好、体系最大、各项功能相对完善的仪器服务平台。

1.2 高校大型仪器平台面临的挑战

目前，我国高校，尤其是“985”“211”研究型大学注重大型仪器平台的建设及学科发展［5-6］，在完成国家级项目、培养硕士和博士研究生方面发挥了积极作用，但是大型仪器在本科生的实验教学中没有发挥其应有的作用和潜能［7］。当前的中国，需要培养创新型人才，而创新型本科人才的培养则需要创新的实验教学。创新的实验教学需要强化大型仪器平台尤其是院级仪器平台的教学功能，将大型仪器用于实验教学，尤其是本科生的实验教学。吉林大学生命科学学院和中国药科大学中药学院面向本科生开放大型仪器的实践取得了较好的效果［8-9］。

我校生命科学技术学院仪器共享与技术服务平台结合自身条件及学科特点，与生命科学与技术国家级实验教学示范中心合作，在细胞生物学实验教学课程中利用超高灵敏微孔板检测成像系统、共聚焦显微镜和流式细胞仪开设了相应的课程。在实验课程设置、实验教学模式、人才培养中进行了实践和探索，取得了较好的效果。

2 大型仪器平台实验教学课探索

2.1 课程设置及简介

以流式细胞术为例，在本科生“细胞生物学实验”课程中设计了利用流式细胞仪检测细胞周期实验。仪器平台分析型流式细胞仪型号为Beckman Cytoflex（见图1），操作简单，自2018 年购买后，在研究生科研中使用率很高，2019 年使用达330 人次；2020 年虽然由于疫情影响耽误了2 个月，但是使用达338 人次。目前，平台流式细胞仪主要应用于细胞凋亡、细胞周期、活性氧、线粒体膜电位、细胞表面标记、细胞计数等方面的检测。2018～2019 年使用流式细胞仪的研究生数据统计，研究生在本科阶段均没有使用过流式细胞仪，所以2019 年开始面向我院国家级实验教学示范中心，结合理论课向本科生开放“利用流式细胞仪检测细胞周期”的实验课程，课程总计4 学时，其中1 学时为课程面授，3 学时为实验课，实验课时约占总课时的75%，以仪器平台作为教学的第二课堂，有助于本科生顺利进入科研训练，为将来的研究生阶段学习奠定坚实的基础。

图1 Cytoflex流式细胞仪

2.2 实验教学大纲

流式细胞仪（flow cytometer，FCM）能对液流中的生物颗粒（如细胞、微生物和人工合成微球等）逐个进行多参数（包括细胞大小、内部结构、DNA 和RNA 含量、细胞表面或胞内蛋白质分子的表达等）快速定量分析和分选，是当代最先进的细胞定性、定量分析以及细胞分选仪器［10］。目前已广泛应用于生物学和临床检验等领域［11］。

细胞是生命活动的基本单位，而细胞周期又与细胞的增殖和分化密切相关。因此，对于细胞周期的检测至关重要［12］。本课程主要介绍流式细胞仪检测细胞周期的原理、方法，以及该仪器在本科生“细胞生物学实验”课程教学中的应用。

楼兰的目光骤然黯淡下来，像一缕极其微弱的火苗，随时可能熄灭。她的手在西双的手心里不安地颤抖起来，越来越快，越来越快……

2.2.1 实验原理

细胞周期（cell cycle）是指细胞从上一次分裂完成到下一次分裂结束所经历的全部过程，包括分裂间期和分裂期（M 期），其中分裂间期又可分为DNA 合成前期（G1 期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）。PI（碘化丙啶）可以穿过破损的细胞膜与细胞内的DNA结合。DNA结合PI的荧光强度可直接反应细胞DNA 含量的多少，且成正比。细胞周期各时期的DNA含量不同。G0/G1 期具有二倍体细胞的DNA含量（2N）；G2/M期具有四倍体细胞DNA 含量（4N）；S期的DNA含量介于2N 和4N 之间。因此，可以用流式细胞仪检测PI 的荧光强度计算细胞周期各时期的百分比。

2.2.2 实验教学设计

以秋水仙素对中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary Cell，CHO）细胞周期的影响为研究对象，结合操作难度和时间等因素，在本科生“细胞生物学实验”课程教学中开展细胞周期检测实验。流式细胞仪的教学可分成理论教学和实验操作两部分。理论教学部分主要以教师集中授课方式进行，根据实验指导向学生讲授细胞周期检测实验的原理、方法、步骤、注意事项及应用等。实验操作部分则为学生实践，数据采集采取现场教学的方式对学生进行仪器使用培训；然后根据仪器使用情况及班级人数，分组进行细胞周期的检测；最后分析实验结果，完成实验报告。

3 教学实例

3.1 仪器

Cytoflex流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）

3.2 实验方法

3.2.1 样品制备方法

取对数生长期的CHO 细胞接种于6 孔细胞培养板中。在5% CO2、37 ℃的条件下培养细胞，细胞完成贴壁后，实验组加入秋水仙素（终浓度10 μg/mL），对照组加入相同体积的生理盐水，18 h 后用胰蛋白酶分别处理并收集对照组及实验组细胞。用2 mL 预冷的PBS洗涤细胞，调整细胞浓度为1 ×106个/mL。取2 mL单细胞悬液，1 000 r/min 离心5 min，去除上清液后，逐滴加入-20 ℃预冷的终浓度为70%的乙醇，4℃固定1 h。取出固定后的样品，低速离心去除上清液。用2 mL预冷的PBS 重悬细胞后，低速离心收集细胞。用0.5 mL预冷的PBS 重悬细胞，加入2.5 μL RNaseA（终浓度为50 μg/mL），37 ℃孵育30 min。最后加入25 μL PI 工作液（终浓度50 μg/mL），室温避光染色5～30 min，用200 目筛网过滤样本后上机。

图2 对照组细胞周期的流式检测图

3.3 结果与讨论

3.3.1 实验结果

流式检测结果如图2 C和图3 C所示。将FCS格式数据导入到Modfit 软件中，先建第1 个门（见图4 A），横坐标为FSC，纵坐标为SSC；利用“门”工具对细胞群进行设门（注意左下脚为细胞碎片，不圈）。再建第2 个门（排除黏连体）（见图4 B），横坐标为FL2-H PE-H，纵坐标为FL2-A PE-A，选中X 轴，在“Edit X parameters”中选择“Fixed upper boundary”和“Linear”；最后选择“analysis population”，横坐标为FL2-A PE-A，选择“Auto”进行拟合周期分析。先分析拟合对照组的周期，再在同样的模板下分析拟合实验组的周期，最终获得对照组和实验组的G1，S，G2 期的比例。分析拟合结果如图4 C 所示，对照组细胞的细胞周期各时相分布为G1 期为66.54%，S期为19.7%，G2/M期为13.76%。秋水仙素处理组细胞的细胞周期各时相分布为G1 期为10.85%，S 期为14.71%，G2/M 期为74.44%（见图5 C）。这表明10 μg/mL的秋水仙素处理18 h导致细胞周期阻滞在G2/M期。

图3 实验组细胞周期的流式检测图

图4 对照组细胞周期分析拟合图

图5 实验组细胞周期分析拟合图

3.3.2 讨论

对照组和实验组的%CV（Coefficient of Variance，CV）值分别为3.52 和3.98，都小于5%，说明G0/G1期的峰正常。对照组和实验组的RCS（Reduced Chi-Square，RCS）值分别为1.755 和2.331，都在要求的0.9-3.0 之间，说明所选择的模式与标本的拟合程度较好。

3.3.3 实验注意事项

（1）使用的玻璃器皿和试剂要干净灭菌，这点很重要。污染脱氧核糖核酸酶会降解DNA，从而影响最终分析质量。

（2）使不同样本含有数目一致的细胞，从而排除染料和DNA之间比率的较大变化。PI和DNA结合的绝对值受样本处理过程的影响，尤其是固定的方法，所以对研究对象做统一的标准试验过程是很重要的。

（3）低速上样（每秒进样细胞数500 个左右，进样速度太快会导致峰形较宽，1 h 内上机，染色与检测的时间过长也容易造成CV增大。

（4）荧光通道线性放大，同时还要注意用AH参数设门排除粘连体。

（5）获取单个有效细胞数至少10 000 个。

3.3.4 教学效果

该实验教学涵盖了从细胞样本制备到上机检测及结果分析的所有步骤，培养了学生的基本实验操作技能，提高了学生分析问题的能力。将该实验内容引入到本科生的生物学实验教学课程，在最大程度发挥我院大型仪器资源优势的同时，使本科生接受良好的专业训练。

4 结语

目前，第二军医大学海医系［13］、贵州大学农业生物工程研究院［14］、河北北方学院生命科学研究中心［15］和南方科技大学生物系生命科学实验教学示范中心［16］等单位都已在本科生实验教学中进行了流式细胞仪的教学探索，取得了较好的成效。自2019 年以来，我院仪器平台流式细胞仪在本科生的细胞生物学实验教学已开放3 年，在实验教学模式改革创新和提升学生实践技能方面取得了一定成效。如2019 年和2020 年参加过该实验教学课的几位本科生在项目中使用流式细胞仪参加国际基因工程机器大赛（iGEM）分别获得金奖和银奖；2019 年参加过该实验教学课的1 位本科生在项目中使用流式细胞仪参加第十六届“挑战杯”全国大学生学术竞赛获得特等奖。由于我院仪器共享与技术服务平台依托于微生物代谢国家重点实验室，很多研究生在微生物科研中均需使用流式细胞仪，所以将流式细胞仪进一步推广至本科生微生物实验教学，培养和提高他们的实践动手能力和科学素养。