唐 超 易晓华 沙元帅 曹靖茹 郭立忠

（青岛农业大学生命科学学院，山东 青岛 266109）

0 引言

醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜为分离介质的一种水平电泳，它具有分辨率较高、微量、快速等优点，被广泛在应用血清蛋白、脂蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面，是医学、兽医学等临床检验的常规技术，也是高校动物类相关专业生物化学经常开设的实验课之一。

醋酸纤维薄膜电泳实验常规缓冲系统为巴比妥-巴比妥钠（0.09mol/L，pH8.6），但是巴比妥类试剂常被用作神经系统镇静剂，有一定毒性，对实验学生和生态环境造成潜在安全隐患。而且巴比妥类试剂属于国家管制药品，价格较高，不适合大批量采购。因此有必要用另一种常见缓冲系统替代巴比妥-巴比妥钠缓冲液，同时优化其实验条件，达到和巴比妥-巴比妥钠缓冲系统一样的实验效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

此次试验选取的初生牛血清。

1.2 仪器和器材

电泳仪（北京市六一仪器厂DYY-10C）；电泳槽（北京六一仪器厂DYC38B）；pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司FE28）；醋酸纤维薄膜（路桥四甲生化塑料厂2cm×8cm）。

1.3 试验设计

缓冲系统优化：选用以下5种常见缓冲系统，离子强度、pH值与巴比妥缓冲系统相同（0.09mol/L，pH8.6）。NaHPO-KHPO、Tris-HCl、硼酸-四硼酸钠、四硼酸钠-HCl、甘氨酸-NaOH。

电极缓冲液离子强度优化：从上述缓冲液中选定一种有可能替代巴比妥缓冲系统的缓冲液，并优化其离子强度，第一次粗分级试验：0.10mol/L、0.13mol/L、0.15mol/L、0.18mol/L、0.21mol/L、0.25mol/L、0.30mol/L、0.35mol/L、0.40mol/L；第二次细分级试验：0.20mol/L、0.22mol/L、0.24mol/L、0.26mol/L、0.28mol/L。

电极缓冲液pH值优化：用pH计调节缓冲液pH值。第一次粗分级试验：pH8.0、pH8.2、pH8.4、pH8.7、pH9.0；第二次细分级试验：pH8.70、pH8.79、pH8.85、pH8.92、pH9.00、pH9.05、pH9.08。

电极缓冲液重复应用次数优化：将电泳后的电极缓冲液倒在烧杯中，混匀后作为下一次电泳的电极缓冲液。重复应用次数设定为：1次、2次、3次、4次、5次、6次。

1.4 试验方法

以上各处理重复6次，除此以外应用以下电泳条件和方法。将醋酸纤维薄膜预浸于电极缓冲液中20min；用镊子取出，放在滤纸上吸干表面液体；用盖玻片一端蘸取少量牛血清，在距离醋酸纤维薄膜一端1.5cm处点样；待样品渗入薄膜后置于电泳槽上电泳；稳压120V，电泳45min；电泳结束后用0.5%氨基黑10B染色液染色5min；用脱色液脱色两次，每次10min。

2 结果与分析

2.1 缓冲系统优化

牛血清蛋白在巴比妥-巴比妥钠缓冲系统下能够明显区分出五条带，见图1（上正下负，以下同），分别是白蛋白、α1蛋白、α2蛋白、β蛋白和γ蛋白。虽然各种缓冲溶液具有相同的离子强度和pH值，但是由于带电粒子本身的特性，在相同电场作用下泳动速率等情况不同，因此NaHPO-KHPO缓冲系统、Tris-HCl缓冲系统、甘氨酸-NaOH缓冲系统无法形成有效区带。血清蛋白在硼酸-四硼酸钠和四硼酸钠-HCl缓冲系统中能够进行有效区分，但只有4条区带。考虑到电泳过程中会产热，硼酸更稳定。因此，用硼酸-四硼酸钠替代巴比妥-巴比妥钠缓冲系统是可行的。

图1 缓冲系统优化结果

2.2 电极缓冲液离子强度优化

电极缓冲液中离子强度直接关系到蛋白质的迁移速率，通常离子强度越低，蛋白质迁移得越快。但样品易扩散，分辨率下降，同时缓冲能力弱，溶液pH稳定性差。因此，对缓冲液离子强度的选择要兼顾这两方面因素。

由图2可知，在离子强度较低的情况下，血清蛋白质区带较为扩散，含量较低的α1蛋白无法观察到，分辨率低。随着离子强度增大，蛋白质越易形成较为凝聚的区带。图3中b~e已经可以获得五条较明显的蛋白区带。但由于学生实验操作时较难把握点样量，点样过多，电泳区带过于凝聚反而会分辨不清楚。因此离子强度维持在0.22~0.26mol/L之间，既能获得较好的电泳分辨率，又能够去除点样过多带来的弊端。

图2 电极缓冲液不同离子强度电泳图谱

图3 电极缓冲液不同离子强度电泳图谱

2.3 电极缓冲液pH值优化

蛋白质在电泳的过程中，电极缓冲液的pH值会影响其带电性和带电量，也影响最终的电泳结果。从图4可以看出，电极缓冲液越偏碱性，蛋白区带越凝聚，当pH值在8.7~9.0之间时能够清晰地分辨出血清蛋白质的五条区带。当pH>9.0以后，蛋白区带过于凝集，学生操作如果点样过量，反而会降低分辨率。为了便于观察实验结果，pH8.7~8.8较为适合。

图4 电极缓冲液不同pH值电泳图谱（粗分级和细分级）

2.4 电极缓冲液重复应用次数优化

由图5可知，电极缓冲液重复使用6次后醋酸纤维薄膜谱带仍然清晰，染色脱色后分辨率较高，并不影响电泳实验效果。重复利用电极缓冲液不但可以节约实验成本，还可以减少环境污染。

图5 电极缓冲液重复利用次数电泳结果

3 讨论

醋酸纤维薄膜电泳具有操作简便、分辨率较高、应用较广等特点，尤其适合在生产实践中应用。操作过程中需要准备的主要试剂就是电极缓冲液，其组成试剂是否容易购置、价格合理，是醋酸纤维薄膜电泳能否在基层得到广泛应用的前提。硼酸和四硼酸钠是常见的化学试剂，价格低廉，无毒无污染，还可以重复应用，是可以替换巴比妥缓冲系统的环保试剂。也可以将硼酸-四硼酸钠根据生产和科研需要制作成试剂盒，进行快速溶解，省时省力。

影响醋酸纤维薄膜电泳结果的因素很多，除了缓冲系统组成、离子强度、pH值、电压、电流以外，醋酸纤维薄膜的质量也是影响电泳效果的重要因素。本试验在分辨率较高的情况下，不同血清蛋白质迁移率比较接近，集中在醋酸纤维薄膜中间部位，这与不同厂家生产的醋酸纤维薄膜孔隙度、均匀度、厚度等都有密切关系。以后可以对不同厂家的醋酸纤维薄膜进行对照试验，在保证分辨率的前提下，增加各种蛋白质迁移率的差异，提高观察效果。

综上所述，在醋酸纤维薄膜电泳中，硼酸-四硼酸钠可以替代巴比妥-巴比妥钠缓冲系统，离子强度在0.22~0.26mol/L之间，pH值在8.7~8.8之间较为适合，重复应用6次也不会影响电泳效果。