梁锦萍，字向东

（西南民族大学动物科学国家民委重点实验室，四川成都 610041）

褪黑素（Melatonin，MLT）因可以使两栖类动物皮肤色泽变浅而得名，最早是从牛的松果腺提取得到，所以也称为松果腺素。除松果体外，胃[1]、卵巢[2]等组织器官也能分泌少量褪黑素。褪黑素在动物机体中参与许多生理过程，作用广泛，如调节胃肠道运动[1]、抗肿瘤作用[3-4]、抗氧化[5]、延缓卵巢衰老[6]、增强免疫力[7]以及调节动物生殖机能[8-10]。本文综述了褪黑素对动物季节性繁殖、卵泡发育、精子发生、体外受精、早期胚胎发育和精液冷冻保存的作用及其作用机制，旨在为畜牧生产实践中褪黑素的使用提供参考。

1 褪黑素概述

1.1 褪黑素的化学性质 褪黑素分子结构为N– 乙酰基–5– 甲氧基色胺，是一种色氨酸衍生物，分子量为232 的吲哚类神经内分泌激素[11]，是微溶于水、易溶于乙醇等有机溶剂的淡白色结晶[12]。

1.2 褪黑素的合成代谢 褪黑素主要由松果腺合成分泌，视交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）接收外界的光周期信号之后，传入松果腺，从而调节褪黑素的分泌[13]。褪黑素的分泌节律表现为明显的昼夜性和季节性，主要受到光照的周期调控，此外也会受到光色、光照强度、温度、动物种类等因素影响[14]。褪黑素分泌的昼夜节律表现为白昼低夜晚高，延长光照会显著降低血清褪黑素水平，而缩短光照则会显著提升血清褪黑素水平。不同的物种、品种之间以及同一品种不同生理时期的褪黑素分泌也存在差异[15-16]。

早期研究认为，褪黑素只能由松果腺合成分泌，后来的研究证明动物体内多种组织器官，如胃、卵巢、胎盘、脑、心、肝等也具有分泌褪黑素的功能[1-2,16-20]，但只有松果腺与视网膜能够进行周期性分泌[13]。褪黑素在动物体内的合成是由5-羟色胺通过芳基烷胺N-乙酰基转移酶（Action of Arylalkylamine N-acetyltransferase，AANAT）和乙酰5-羟色胺一氧甲基转移酶（Acetylserotonin O-methyltransferase，ASMT）也称羟吲哚一氧甲基转移酶的顺序作用合成[19]。褪黑素在体内经肝脏降解，细胞色素P450 酶的亚型对褪黑素进行6-羟基化，产生6-羟基褪黑素，进一步催化褪黑素中的氧进行去甲基化，得到去N-乙酰-血清素（N-乙酰-5-羟色胺），最后被硫酸化或者葡萄糖醛酸化，其代谢产物随尿液排出[21]。

1.3 褪黑素受体 褪黑素受体1（Melatonin Receptor 1，MT1）和褪黑素受体2（Melatonin Receptor 2，MT2）是褪黑素的2 种亚膜型受体，存在于多种动物中，均属于G 蛋白偶联受体家族。而褪黑素受体3（Melatonin Receptor 3，MT3）是一种胞质酶-醌还原酶2，与MT1、MT2 并不相似，与褪黑素的结合能力更弱。除此之外，褪黑素还具有核受体，即维甲酸Z 受体/维甲酸相关孤核受体（RZR/ROR）超家族的孤儿核受体，通过核受体途径也能完成褪黑素的某些生物功能[18]。

MT1、MT2基因在成年母猪的脑、卵巢、肾脏、心脏等器官以及脂肪等组织中均有表达，并且在卵巢和脑组织中的表达显著高于其他器官组织[22]。也有研究发现，MT1基因在藏绵羊整个发情周期的下丘脑、垂体、卵巢以及输卵管和子宫中均有表达[23-24]。还有研究发现MT1 和MT2 在妊娠奶山羊卵巢[25-26]表达，在人的乳房、卵巢、子宫和胎盘[16]以及啮齿动物腹股沟和附睾脂肪细胞、人类白色脂肪组织和棕色脂肪组织中都有表达[27]。

2 褪黑素与动物的季节性发情调控

动物的季节性繁殖是其长久以来适应环境，使后代在最适宜的季节中出生，更好地生长发育而形成的一种节律性生活特征。光照是引起动物季节性繁殖的重要因素之一，而光照的周期变化会引起动物体内褪黑素的周期性变化。褪黑素能参与多种动物的繁殖调控，特别是季节性繁殖动物。季节性繁殖的动物可以分为长日照型（马、驴、猫等）和短日照型（绵羊、山羊、鹿等）[14]。长日照型高原鼠兔的脑和血清中的褪黑素水平在非繁殖期极显著高于繁殖期[28]。褪黑素能够降低家猫促黄体素（Luteinizing Hormone，LH）水平，补充外源性褪黑素可以有效抑制母猫卵巢的活性，因此可以通过注射褪黑素给家猫避孕[29]。而短日照型动物则相反，体内埋植褪黑素可以提高非发情季节的母鹿体内的卵泡刺激 素（Follicle Stimulating Hormone，FSH）和LH 浓度，促进其卵泡发育、发情排卵[30]。褪黑素在下丘脑-垂 体-性腺轴（Hypothalamus Pituitary Gonad Axis，HPGA）上可以调节下丘脑分泌的促性腺素释放激素（Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH）的分泌，但是在不同物种上的作用表现不同[31-32]，褪黑素也能直接影响由垂体前叶合成和分泌FSH、LH 及其受体的表达[30,33]。综上所述，褪黑素对季节性繁殖的调控在不同物种之间存在差异，对长日照动物来说是抑制因子；对短日照动物来说是促进因子[34]。

研究发现，视网膜接收季节性光照光信号的变化后通过SCN 传递到松果腺从而调节褪黑素的分泌[13]。褪黑素作用于MT1，并通过促甲状腺激素（Thyroidstimulating Hormone，TSH）-TSH 受体（TSHR）信号通路调节和2 型甲状腺素脱碘酶（Type 2 Iodothyronine Deiodinase，DIO2）和DIO3 的表达和转换，最终通过甲状腺素（Thyroid Hormone，TH）作用于HPGA，调控哺乳动物的季节性繁殖活动[34-35]。除了通过上述的TH调控通路外，褪黑素还有可能靶向亲吻素（Kisspeptin，Kp）和RF酰胺相关肽（RF Amide-related Peptide，RFRP）调节GnRH 神经元的活力，影响GnRH 的分泌，参与动物的季节性繁殖调控[36]。在HPGA 中，褪黑素与促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-inhibitory Hormone，GnIH）对动物繁殖活动的调控具有协同作用，但褪黑素如何影响GnIH、在整个繁殖活动中两者作用之间的关系仍有待进一步研究[37]。

3 褪黑素对雌性动物生殖机能的调控

3.1 褪黑素对卵巢的调控作用 通过100 μmol/L 褪黑素处理能够显著增加体外培养的小鼠卵泡中雄激素和孕酮的产生[38]。褪黑素是通过调节大鼠类固醇合成基因（CYP17A1）的表达来影响卵泡类固醇的产生[39]。而褪黑素可以影响体外培养的猪颗粒细胞增殖和类固醇生成[40]。褪黑激素通过下丘脑-垂体-性腺轴调节FSH及LH 的分泌进而影响性腺生殖激素的分泌；也可以通过血液直接作用于卵巢褪黑素受体调控类固醇性激素分泌[41]。MT1基因敲除小鼠的褪黑素信号通路阻断，导致瘦素水平降低、类固醇激素分泌减少和产仔数减少。补充瘦素可以改善MT1基因敲除小鼠的排卵，恢复类固醇激素水平[27]。猪瘦素缺失不影响褪黑素的合成，但会降低产仔数和类固醇激素，可以认为瘦素是褪黑素调控小鼠和猪雌性生殖的下游靶点[27]。

卵巢的衰老主要表现在卵巢卵泡和卵母细胞数目的减少，具有正常染色体分布的卵母细胞百分比降低，体外受精后原核形成的持续时间变长以及卵母细胞发育潜力下降。褪黑素处理组雌性ICR 小鼠在10～43 周龄只饮用含褪黑素的水（100 μg/mL），其原始卵泡、初级卵泡和窦状卵泡以及卵母细胞数量都多于对照组[42]。在昆明小鼠上的研究发现，褪黑素可以延缓卵巢衰老导致的卵母细胞数量下降，减少因衰老引起的闭锁卵泡数量，但是并不能完全阻止卵泡消失[6]。

活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）导致氧化应激，损伤卵泡内的卵母细胞和颗粒细胞[43]。已有研究发现，褪黑素在牛卵巢发挥抗氧化作用，降低卵巢的氧化应激[44]；保护人类颗粒细胞[45]和卵母细胞免受氧化应激的损伤[46]；减少小鼠卵泡颗粒细胞的细胞核、线粒体和质膜中毒氧化应激[47]。

3.2 褪黑素对卵泡发育的调控 神经内分泌、旁分泌和自分泌调控着卵泡的生长发育。褪黑素可以通过局部的旁分泌和自分泌影响卵泡生长发育[18]，也能够通过影响其他性腺激素的合成与分泌从而调节卵泡的生长发育。体内埋植褪黑素可以加快山羊优势卵泡的生长，从而提高卵泡的发育能力[48]。此外，褪黑素的抗氧化和抗细胞凋亡作用也能保护卵泡在生长发育过程中免受ROS 等氧化物质的损伤。健康卵泡颗粒细胞中褪黑素受体MT1 和MT2 表达显著高于闭锁卵泡[22]，说明褪黑素及其受体可能在卵泡发育与闭锁调控中发挥着重要作用。

3.3 褪黑素对卵母细胞体外成熟的影响 卵母细胞体外成熟（In vitromaturation，IVM）已成为现代胚胎生物技术的重要内容之一，是体外受精（IVF）、核移植（Nuclear Transfer，NT）等生物技术的重要环节。褪黑素除了对体内的卵母细胞有益作用外，对卵母细胞体外成熟也能发挥作用。褪黑素（10-7mol/L）通过清除ROS 和调节类固醇激素的产生，显著促进猪卵母细胞的体外成熟，并且可以保护线粒体，使猪卵母细胞免受热应激损伤[49]。褪黑素（10-9mol/L）可以显著降低玻璃化冷冻的牛卵母细胞的ROS 水平，抑制细胞凋亡，从而增加其发育潜力[10]。

褪黑素促进人卵母细胞成熟的抗氧化作用是通过增强网格蛋白介导的内吞作用（Clathrin-mediated Endocytosis，CME）来实现的，其表现为包被核和囊泡数量的增加，同时用于组装核和囊泡的主要蛋白表达上调[50]。在牛卵母细胞IVM 中，褪黑素通过去甲基化来调节基因和蛋白的表达[51]。这些发现揭示了褪黑素在IVM 过程中改善卵母细胞质量的潜在机制。此外，应用褪黑素可以减少百草枯（Paraquat，PQ）对牛卵母细胞的损伤，显著减轻PQ 对IVM 卵母细胞的毒性作用[52]。以上结果证明，褪黑素可以促进卵母细胞的成熟，并且减少卵母细胞的氧化应激损伤，在卵母细胞IVM中发挥重要作用[53]。

4 褪黑素对雄性动物的生殖机能调控

4.1 褪黑素对精子发生的调控 睾丸间质细胞对精子的发生具有重要作用。褪黑素能够提高小鼠睾丸间质细胞活力[54]，抑制细胞凋亡，从而调控精子发生。连续注射褪黑素拮抗剂，能够诱导非繁殖时期的高原鼠兔恢复其生殖细胞发育和精子发生，可以认为褪黑素节律性分泌可以介导调控高原鼠兔季节性精子发生[55]。在体外培养条件下，10-7mol/L 的褪黑素能显著促进萨福克羊的精原细胞分化为功能性单倍体精子细胞[56]；同时，褪黑素受体普遍存在于精子发生的各级细胞中，且在动物受精阶段表达水平最高[57]。这些研究证明褪黑素及其受体参与调控精子发生过程以及体外生精细胞单倍体发育。

4.2 褪黑素对精子质量的影响 高内源性褪黑素浓度可以提高人精子质量，短期体外的褪黑素处理可改善精子活力[58]；每天补充6 mg 褪黑素可以增加机体褪黑素水平并减少精子DNA 造成的氧化损伤[59]。10-5mol/L 和10-3mol/L 褪黑素可提高细胞质膜完整性、线粒体活性和顶体完整性，显著降低细胞内ROS 水平，在牛精子获能过程中发挥抗氧化性能，改善获能后的精液品质，有助于提高受精率和体外胚胎发育[60]。褪黑素能够延长常温保存的猪精液的有效存活时间[61]。在猪精液稀释液中添加一定量的褪黑素可以有效缓解热应激引起的精子质量下降，但对精子活率并没有显著影响[62]。羊精液低温保存条件下添加适宜浓度褪黑素（20 mg/L）能够提高精子品质，但褪黑素浓度过高（≥80 mg/L）保存效果反而下降[63]。0.003 mmol/L 褪黑素对鸡精液保存有明显作用，但过高浓度的褪黑素对鸡精液保存有抑制作用[64]。0.5 mg/mL 褪黑素能提高绒山羊的精子抗氧化能力以及冷冻保存效果[65]。

5 褪黑素对受精与早期胚胎发育的影响

5.1 褪黑素对受精作用 受精作用的关键在于卵母细胞和精子的质量以及精子的获能。褪黑素可以通过促进卵母细胞的成熟，进一步促进克隆胚胎和体外受精及其早期胚胎发育[53]。从被褪黑素处理过的小鼠体内取出的卵母细胞体的外受精率和囊胚率都有所提高[42]。有研究证明，褪黑素可以通过改善细胞器的正常分布，提高细胞内谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和ATP 水平，增强抗氧化基因表达水平，调节受精相关过程，从而提高牛卵母细胞的受精能力和发育能力[51]。精子获能是顺利完成受精中至关重要的一个环节。精子在体外获能的过程中会产生高浓度ROS，造成对精子的氧化应激，而褪黑素的抗氧化性质恰好可以减少这种伤害，利于精子的体外获能以及胚胎的早期发育。褪黑素对精子获能有直接的调节作用，在低剂量（100 pmol/L）时有激活作用，在高剂量（1 μmol/L）时有抑制作用[66]。

5.2 褪黑素对早期胚胎发育的影响 褪黑素对卵巢、卵母细胞以及精子的作用，都将进一步影响早期胚胎发育。有研究发现，牛孤雌胚胎早期发育中存在褪黑素受体MT1 蛋白的表达，并且MT1 在牛孤雌胚胎发育的各个时期均有表达，并且呈逐渐增多的趋势[67]，证明褪黑素通过与MT1 结合对牛早期胚胎发育起到重要的调节作用[8]，这在猪和羊等动物中也得到了证实[68]。褪黑素处理（10-3mol/L）牛精子后进行体外培养得到的胚胎的囊胚发育率显著提高，而囊胚中凋亡细胞核的发生率显著降低[60]。褪黑素预处理可以抑制PQ 对牛胚胎的氧化损伤，其抗凋亡性有助于稳定细胞内氧化还原状态从而保护胚胎活性[69]，这说明褪黑激素可以增强牛胚胎在氧化应激条件下的发育潜力。褪黑素还能提高冷冻小鼠2-细胞胚胎的体外发育能力[70]。

6 小 结

褪黑素及其受体在多种动物的多种器官、组织细胞中广泛存在，并且在机体各个系统中发挥作用，参与调节各种生理活动，如褪黑素参与调控动物的季节性繁殖、影响动物内分泌。雌性动物褪黑素可以延缓卵巢衰老，调节卵泡发育，抵抗氧化应激损伤，促进卵母细胞的成熟。雄性动物褪黑素能调控精子发生，提高精子质量，改善精液品质与提高精液保存的质量。褪黑素在卵母细胞IVM，精液冷冻保存以及精子获能过程中发挥着重要作用，提高了IVF 能力以及早期胚胎发育的潜能。但不同物种的配子、胚胎所需外源褪黑素的适宜浓度不同，仍然需要进一步研究确立褪黑素对于各种家畜家禽的有效安全的添加浓度。随着对褪黑素作用机理研究的深入，褪黑素在人工授精、体外受精和胚胎移植等生殖工程领域将发挥更加重要的作用。