齐士勇，徐勇

(天津医科大学第二医院泌尿外科 天津市泌尿外科研究所，天津 300211)

我国是世界上肾结石的高发地区。统计学数据显示，我国成人肾结石的发病率高达5.8%[1]，其中80%的肾结石含有草酸钙，且以草酸钙为主要成分，肾脏结石的复发率可达70%以上[2-3]，严重影响患者身体健康，且加重医疗负担。因此，寻找有效的草酸钙肾结石防治措施有助于解除患者痛苦、降低医疗支出，而阐明结石的形成机制是其关键。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)3炎症小体是位于细胞质内的蛋白质复合体。外源性危险信号(如病原微生物)和内源性危险信号(如草酸钙晶体)可激活效应细胞内的NLRP3炎症小体，进而释放效应分子[如白细胞介素(interleukin，IL)-18 和IL-1β等]促进疾病的发生。目前一致认为，NLRP3炎症小体激活与炎症疾病的发生相关。但随着认识的深入，NLRP3炎症小体在代谢性疾病发生、发展中的作用受到重视。草酸钙结石是常见的肾脏代谢性疾病。有文献报道，草酸钙肾结石形成过程中存在NLRP3炎症小体的激活，且其激活依赖于大量活性氧类(reactive oxygen species，ROS)的产生[4-6]。然而，NLRP3炎症小体激活及其激活后促进草酸钙结石形成的具体机制仍不清楚。现就NLRP3炎症小体及其激活途径、激活后造成肾小管上皮细胞损伤以及导致肾小管上皮黏附性改变的机制进行综述。

1 NLRP3炎症小体的构成及生物学作用

NLRP家族成员在机体的固有免疫中起着关键性作用，可激发机体免疫应答、清除有害刺激。目前，在人类细胞内已发现23种NLRP家族相关分子，在小鼠等动物细胞内已发现34种以上NLRP分子[7]。NLRP家族激发机体产生免疫应答的功能与其特殊的分子结构相关。典型的NLRP结构包括以下三个关键部分：①N端结构域为发生效应的区域，可促进不同蛋白分子之间发生生物学效应；②中间NOD结构域为连接区域，可导致NLRP分子本身的寡聚化，发挥相互连接功能；③C端为亮氨酸富集的结构域，可进行自身调控并识别病原体相关分子。既往研究发现，NLRP1可与胱天蛋白酶(caspase)5结合，通过凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)与caspase-1发生相互作用，进而形成蛋白质复合体，将其命名为炎症小体[8]；炎症小体进一步活化caspase-1前体使其转变为有功能的caspase-1，促进炎症因子(如IL-1β)的成熟及释放，最终发生相应的生物学效应。自此，NLRP家族相关炎症小体及其激活促进疾病发生发展的作用受到广泛的重视和研究。

在NLRP家族众多成员中，NLRP3炎症小体与疾病关系最为密切，且研究最多。NLRP3炎症小体的组成包括NLRP3、无活性caspase-1和ASC。NLRP3与NLRP其他家族成员均具有典型的特征性结构域，即C端是识别相应配体并进行自身调节的含亮氨酸的富集区域，中间区域为起连接作用的NBD区域(也称为NOD或NACHT区域)，此区域属于核苷水解酶超家族成员，可将ATP水解成鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)；N端含有一个caspase募集结构域(caspase recruitment domain，CARD)或称热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)的效应结构域，其与具有相同结构域的其他分子结合产生一系列生物反应，进而参与机体效应细胞的炎症反应过程，其中最关键的是该区域可通过CARD-CARD连接的方式使ASC发生聚集。ASC在NLRP3炎症小体复合体中起着连接蛋白的作用，其C端含有与caspase-1前体相同的PYD募集结构域，N端则含有与NLRP3相同的CARD连接结构域。通过CARD-CARD及PYD-PYD的桥梁作用，ASC将caspase-1前体与NLRP3连接，从而起到双重衔接蛋白的作用。当caspase-1前体富集区域达到相对较高浓度时，蛋白酶原以水解的方式将四聚体自身活化，从而形成具有蛋白酶活性的异二聚体caspase-1，此过程称为NLRP3炎症小体激活。炎症小体激活后，caspase-1作为效应蛋白进一步剪切无活性的IL-1β及IL-18前体，使其转变为成熟的IL-1β和IL-18。效应细胞释放IL-1β和IL-18，从而引起炎症反应[9]。

2 NLRP3炎症小体激活途径和负性调节

外源性或内源性刺激信号激活效应细胞内的NLRP3炎症小体，其激活分为两个阶段：①启动环节，即NLRP3表达上调。②激活环节，即NLRP3炎症小体形成，促进caspase-1及IL-1β等效应分子产生[10]；进而caspase-1参与细胞的程序性死亡，IL-1β促发组织的炎症反应。

激活NLRP3炎症小体的危险信号包括外源性和内源性信号。外源性信号包括各种微生物(细菌、真菌及病毒等)及其代谢分子。不同种类微生物激活NLRP3炎症小体的方式不同，就细菌而言，多数革兰阳性球菌及革兰阴性杆菌能够通过细胞内氧化应激方式激活NLRP3炎症小体，诱发机体的免疫应答，从而发挥保护机体的作用；在真菌方面，白假丝酵母菌及酿酒酵母菌可以利用脾脏酪氨酸激酶介导的细胞信号通路促进NLRP3炎症小体活化，从而激发炎症反应；就病毒来讲，不同病毒激活炎症小体的方式不同，腺病毒能通过其DNA发挥作用激活NLRP3炎症小体，而一些流感病毒利用M2离子通道的开放引起细胞内相关离子(如钾离子)浓度改变激活NLRP3炎症小体；另外，一些病原微生物可产生毒素使细胞膜发生破坏，导致细胞内外离子浓度改变，进而激活NLRP3炎症小体[11]。内源性危险信号主要指体内一些代谢产物[12]，包括草酸钙结晶、胆固醇结晶、尿酸结晶、胱氨酸结晶及某些多肽物质等。NLRP3炎症小体可被上述内源性代谢产物激活，促进效应分子IL-1β等释放，引起一系列代谢性疾病的发生。因此，NLRP3作为一种模式识别受体在识别多种内外源性危险信号过程中起着关键性作用。各种危险信号促使NLRP3炎症小体激活的确切机制仍不清楚，可能与激活离子途径、ROS和溶酶体途径及负性调控有关[13]。

2.1离子途径激活 钾离子外流是NLRP3炎症小体激活最常见的机制。此过程中，细胞内的钾离子顺着离子浓度梯度向细胞外流动，从而诱导线粒体功能受损、破坏，进而导致ROS和线粒体DNA释放，激活NLRP3炎症小体。有关钾离子外流的机制尚不完全清楚，目前有以下几种解释：危险信号直接破坏细胞膜，钾离子顺浓度梯度外流[14]；细胞周围环境内的ATP与细胞膜上的P2X7受体结合并激活该受体，进而诱发其控制的膜离子通道蛋白开放，引起细胞内钾离子外流[15]；一些微生物作用于效应细胞后介导细胞膜微孔结构形成，通过这些微孔结构钾离子亦可发生外流[16]。

钙波传递是细胞之间信息交流的一种途径，NLRP3炎症小体激活过程中钙波传递起重要的调节作用。钙波传递激活NLRP3炎症小体的机制可能是钙离子与钙离子受体结合导致钙离子受体活化，进而激活NLRP3炎症小体。在钙波传递过程中，钙离子受体活化引起NLRP3炎症小体激活可能存在以下两方面的作用：①钙离子受体活化后导致内质网内的钙离子被释放，引起细胞内钙离子浓度呈持续增高，继而损坏线粒体的功能并释放线粒体DNA导致NLRP3炎症小体激活[17]；②钙离子受体活化后可引起细胞内环腺苷酸水平降低，从而削弱了环腺苷酸对NLRP3炎症小体激活的抑制作用，导致NLRP3炎症小体激活增加。此外，细胞外的钙离子还可通过G蛋白偶联受体激活NLRP3炎症小体[18]。

2.2ROS和溶酶体途径激活 ROS在NLRP3炎症小体激活过程中亦起着重要作用。近年来，线粒体来源ROS在此生物过程中起着主导作用。ROS抑制剂可抑制NLRP3炎症小体激活，减轻靶细胞的损伤，进而延缓疾病的发展。细胞膜上还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的激活与大量ROS的产生密切相关。当机体效应细胞(如巨噬细胞)出现吞噬障碍，不能清除有害物质时，内源性晶体物质(如草酸钙、尿酸、胱氨酸)可激活细胞膜还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，导致细胞内ROS大量生成。ROS进一步产生生物学效应，导致原本处于结合状态的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白交互蛋白发生分离。两者分离后，硫氧还蛋白主要通过自身氧化清除氧化物；硫氧还蛋白交互蛋白则与NLRP3相应的结构域结合，从而募集caspase-1及ASC前体，完成NLRP3炎症小体的组装，最终诱导NLRP3炎症小体激活[19]。

另有研究发现，巨噬细胞在内吞病原体或晶体类物质后，可导致细胞内溶酶体发生破裂。溶酶体破裂后，其内的一些蛋白酶(如组织蛋白酶B)释放至细胞质内[20]，后者导致效应细胞细胞膜离子通道开放，引起细胞内离子浓度发生改变，继而促进NLRP3炎症小体激活。Bruchard等[21]研究发现，使用小分子物质直接破坏溶酶体亦能导致NLRP3炎症小体激活，揭示了效应细胞溶酶体破坏对于NLRP3炎症小体激活的意义。

2.3NLRP3炎症小体激活的负性调节 NLRP3 炎症小体激活导致效应蛋白IL-1β和IL-18等的成熟和释放，在感染疾病的控制中起着重要作用。目前，NLRP3炎症小体过度激活导致的机体损伤被认为是代谢性疾病发生的根本原因。NLRP3炎症小体过度激活与其抑制性调节机制受损存在一定关系。了解炎症小体激活的负性调控机制有助于维持机体内环境稳态，并为代谢性疾病的治疗提供新思路、新靶点。

现已发现的NLRP3炎症小体激活负性调节机制包括[22]：①负调控蛋白机制，该类蛋白主要包括具有PYD结构域的蛋白(如热激蛋白)及具有CARD结构域的蛋白(如caspase-12)，其主要作用是竞争性抑制NLRP3炎症小体的激活；②细胞自噬机制，细胞自噬具有双重作用，当自噬功能受损时NLRP3炎症小体激活增强、活性caspase-1表达增加，表明细胞自噬具有负向调节NLRP3炎症小体激活的作用；③其他机制，T细胞、干扰素、一氧化氮及miR-223等均可抑制NLRP3炎症小体的激活，但其机制尚未完全明确。

3 NLRP3炎症小体激活与草酸钙肾结石形成

最初，NLRP3炎症小体激活被认为与自身炎症性疾病(如周期性发热)的发生相关。随着研究的深入，发现在多种代谢性疾病(如2型糖尿病、糖尿病心肌病、痛风、肥胖及非酒精性脂肪性肝炎)的发生发展过程中均存在NLRP3炎症小体激活[23-24]。草酸钙肾结石是一种代谢性肾脏疾病，是草酸刺激肾小管上皮细胞发生氧化应激反应而产生过量ROS，导致上皮细胞损伤和肾小管上皮细胞黏附因子表达增加，最终引起草酸钙结晶的细胞黏附，并形成肉眼可见的结石。因此，外源性危险信号草酸刺激肾小管上皮造成肾小管上皮细胞的损伤和细胞晶体黏附性增加是草酸钙结石形成的关键因素。研究显示，使用一定浓度草酸喂养NLRP3基因缺失小鼠形成的肾脏草酸钙结石密度较正常小鼠明显降低[25]。另有研究显示，NLRP3基因缺失小鼠肾小管上皮细胞内caspase-1及IL-1β表达水平较正常小鼠亦显著下降[6]。可见，NLRP3炎症小体激活在草酸钙肾结石形成中起着关键性作用。既往研究多关注NLRP3炎症小体是否参与了草酸钙结石的形成，缺乏对NLRP3炎症小体激活促进草酸钙肾结石形成确切机制的研究。近年来，NLRP3炎症小体激活促进草酸钙结石形成机制研究的焦点和难点主要包括NLRP3炎症小体激活造成肾小管上皮细胞损伤类型和本质以及肾小管上皮细胞晶体黏附性改变[26]。

3.1NLRP3炎症小体激活与肾小管上皮细胞损伤 草酸钙肾结石由无机盐和有机成分组成，无机盐主要是草酸钙，可与水分子形成不同形式的螯合物；有机成分包括各种蛋白物质，主要来源于肾小管上皮细胞的损伤。抑制NLRP3炎症小体激活可减轻效应细胞损伤、保护细胞功能，有助于延缓部分代谢性疾病的发展、优化疾病的预后。因此，明确NLRP3炎症小体激活造成细胞损伤的类型和机制有助于减少肾小管上皮细胞损伤并寻找疾病新的治疗靶点。

研究发现，ROS通过激活NLRP3炎症小体造成肾小管上皮细胞损伤，进而促进草酸钙结石形成[27]。在此过程中，ROS-NLRP3相关肾小管上皮细胞损伤可分为间接损伤和直接损伤。间接损伤是指肾间质树突状细胞中NLRP3炎症小体激活，诱发肾脏间质炎症反应，效应细胞释放炎症因子造成肾小管上皮细胞损伤；直接损伤是指受草酸刺激后肾小管上皮细胞内NLRP3炎症小体激活释放效应分子caspase-1造成肾小管上皮细胞焦亡。对肾小管上皮细胞间接损伤的研究发现，高草酸前体物质饮食大鼠及小鼠的肾组织内草酸钙结晶广泛沉积，晶体与肾间质树突状细胞作用诱发间质炎症反应，继发形成肾脏瘢痕，导致肾小管上皮细胞损伤，最终引起肾脏功能丧失[4]。因此，在上述病理过程中，树突状细胞内NLRP3炎症小体激活起着关键性作用，即草酸钙晶体导致树突状细胞内发生氧化应激，ROS生成增加，进而激活NLRP3炎症小体，并产生效应分子IL-1β和IL-18，最终募集白细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润，造成肾小管上皮细胞损伤，此类损伤可被IL-1R拮抗剂阻断[28]。然而，草酸诱发的肾损伤并非依赖单一效应细胞分泌IL-1β，亦可通过其他途径实现肾小管上皮的损伤。NLRP3炎症小体激活后，亦可利用转化生长因子受体相关信号通路及巨噬细胞极化诱发肾间质的炎症反应，造成肾小管上皮细胞损伤[29]。

目前，对ROS-NLRP3炎症小体激活所导致的肾小管上皮细胞损伤的研究多集中在草酸钙晶体-树突状细胞相互作用诱发肾脏间质炎症反应所致的间接损伤方面。然而，对于肾小管上皮细胞内NLRP3炎症小体激活所造成的直接损伤(细胞焦亡)的研究较少。细胞焦亡是一种特殊形式的细胞损伤，是由caspase家族介导的细胞程序性死亡[30]。细胞焦亡的特点是危险性信号导致细胞膜膜孔形成，细胞发生肿胀并最终出现渗透性裂解[31-32]。研究证明，细胞焦亡参与多种代谢性肾脏疾病(如糖尿病肾病、高血压肾病及高尿酸肾病)的发生、发展[33]。作为一种代谢性肾脏疾病，草酸钙肾结石形成与细胞焦亡的相关性受到关注。研究显示，草酸可通过ROS激活NLRP3炎症小体造成肾小管上皮细胞损伤、促进结石形成[34]，并在此过程中存在肾小管上皮细胞焦亡[35]。然而，在草酸钙结石形成过程中，NLRP3炎症小体激活导致肾小管上皮细胞焦亡的机制尚不完全明确，尤其是肾小管上皮细胞焦亡发生时细胞膜孔形成的机制以及有关细胞膜孔大小、多少、深度及密度的研究仍缺乏，尚需进一步研究。

3.2NLRP3炎症小体激活与肾小管细胞晶体黏附性改变 草酸钙肾结石的形成是一个复杂的病理生理过程，包括晶体的细胞黏附、细胞表面聚集及肾小管腔内成核等，受诸多因素的调控。肾小管上皮细胞对草酸钙晶体的黏附是结石形成的始动因素，主要依赖于上皮细胞晶体黏附因子表达增加。常见的细胞晶体黏附因子包括透明质酸、骨桥蛋白及CD44，晶体黏附因子的表达受细胞内多种信号通路的调控[36-37]。

目前有关NLRP3炎症小体激活与肾小管上皮黏附性改变的研究尚少。研究发现，NLRP3基因缺失小鼠在高草酸饮食后，肾小管上皮细胞的细胞膜晶体黏附因子透明质酸酶和骨桥蛋白的表达水平下降，且草酸钙结石形成程度较正常组小鼠明显减少[6]。可见，炎症小体通过改变细胞对草酸钙晶体黏附性激活促进结石形成，但目前尚缺乏其相关机制的研究。初步的探索发现，ROS可通过调节p38促分裂原活化的蛋白激酶通路相关蛋白的表达上调透明质酸、骨桥蛋白及CD44等黏附因子的表达，进而增强肾小管上皮细胞对草酸钙结晶的黏附性，促进草酸钙结石的形成[38]。进一步研究发现，NLRP3炎症小体激活在ROS-p38促分裂原活化的蛋白激酶通路改变细胞晶体黏附性、促进结石形成过程中起到承上启下的作用，其通路相关节点关键蛋白(磷酸化p38及c-Jun等)起着重要作用[35]。目前对NLRP3炎症小体激活促进肾小管上皮细胞晶体黏附性增加的研究取得了一定进展，但其机制尚不完全清楚，仍需进一步研究。

4 小 结

NLRP3炎症小体是NLPP家族的重要一员，NLRP3炎症小体激活不仅与炎症性疾病相关，还与诸多代谢性疾病相关。作为代谢性肾脏疾病的一种，草酸钙肾结石的发生与肾小管上皮细胞内NLRP3炎症小体激活密切相关。NLRP3炎症小体的激活依赖于内源和外源性危险信号的刺激，其激活途径具有多样性和复杂性，同时受多种负性调控机制的调控。NLRP3炎症小体激活后可通过“肾小管上皮细胞损伤”和“肾小管上皮细胞晶体黏附性改变”两方面作用促进草酸钙肾结石的形成。目前虽然对NLRP3炎症小体激活在草酸钙肾结石形成中作用的研究取得了一定的成果，但对于NLRP3炎症小体激活机制、肾小管上皮细胞损伤机制及上皮黏附因子表达改变的机制仍需进一步深入研究，以期为寻找草酸钙肾结石的防治靶点提供科学依据。