王趁芳， 顾动地， 张 莉， 吴 昊， 熊宪献，肖明松， 顾有方,4， 靳二辉,4， 金光明,4*

(1.安徽科技学院 生命与健康科学学院,安徽 凤阳 233100；2.安徽科技学院 动物科学学院,安徽 凤阳 233100；3.安徽省兽药饲料监察所,安徽 合肥 230000；4.动物营养调控与健康安徽省重点实验室,安徽 凤阳 233100)

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种急性传染病,主要引起严重体液免疫和细胞免疫抑制,导致免疫功能下降,继而增强机体易感性,造成多种疫苗免疫保护失败,对养鸡业造成巨大经济损失。

中草药都是我国独特的医药资源,在维持和增强人类和动物健康方面具有极为重要的作用。许多中草药本身不仅含有丰富的营养物质,而且具有较大的药效价值,再加上中草药具有多靶点、多效性、毒副作用小、体内不残留等独特优点,在畜禽养殖生产中被广泛应用。研究发现,许多中草药能够促进畜禽生长,增强机体免疫力和抗氧化功能、预防和治疗致病微生物感染,减少西药使用成本,提高养殖经济效益,是一类较为理想的绿色饲料添加剂产品。熊宪献等研究发现,青脚麻鸡日粮中添加适量的由金银花、黄连等配制的中草药复方制剂,可促明显促进脾脏发育,改善脾脏组织结构,促进细胞增殖,抑制凋亡,提高脾脏免疫功能。饲粮中添加中药王枣子超微粉可提高21 d肉鸡生长性能和抗氧化功能。李美莹等对海蓝褐公雏鸡研究发现,在饮水中添加黄党银淫甘组方(黄芪、党参、银杏外种皮、淫羊藿、甘草)可显著提高免疫器官指数(胸腺、法氏囊、脾脏),促进淋巴细胞增殖,提高机体免疫功能。吕殿红等研究报道,给经ND和IBD疫苗常规免疫的54 d岭南黄鸡饮服灵芝、黄芪等组成的中药复方制剂,可显著增加血清ND和IBD抗体水平和体重。刘俊烨通过研究由黄芪、金银花、甘草等组成的复方中草药对人工感染肉鸡法氏囊病毒的保护作用,发现混饮高、中剂量的复方中草药制剂对感染肉鸡的保护率达到92%和90%,并能显著的减轻病鸡法氏囊和胸腺等免疫器官的病变,且雏鸡免疫器官指数都有所增加。

中草药及其复方制剂对于提高畜禽抗病力，预防和治疗畜禽传染性疾病具有具有明显优势。目前，有关中草药及其复方制剂调节畜禽机体免疫功能的报道较多，但对其作用机制的报道较少，尤其关于中草药对人工感染畜禽细胞增殖和凋亡的研究更是鲜有报道，一定程度上影响了中草药复方制剂在畜禽养殖生产中的应用。胸腺是畜禽中枢免疫器官之一，是T细胞分化、发育、选择和成熟的重要场所，其功能和状态与免疫功能密切相关。为此，本试验以鸡传染性法氏囊病对肉鸡免疫器官、免疫功能损伤作用为关注点，参照中草药特性以及组方原则，选配有针对性的中草药组方，经超微粉碎加工，研究其对感染鸡传染性法氏囊病毒的青脚麻鸡胸腺显微结构、细胞因子和细胞凋亡相关基因表达的影响，旨在为预防和治疗肉鸡传染性法氏囊病的新型复方中草药制剂研发提供科学资料。

1 材料与方法

1.1 复方中草药复方制剂

复方中草药制剂主要由金银花、黄连、黄芪、熟地黄、蒲公英、甘草组成(购于安徽省亳州市德隆药业集团)。主要成分经青岛科标研究院检测(其有效成分为甘草苷29.52 mg/kg,黄连素1 008.83 mg/kg,绿原酸161.9 mg/kg,总多糖1.85%,总黄酮25.64%)。

1.2 IBDV毒株

本试验所用IBDV毒株类型、攻毒方式和剂量主要参考孙雨豪等报道。

1.3 动物饲养和试验设计

125羽28日龄健康青脚麻鸡(未接种IBD疫苗),按照体重相近原则随机分为对照组,攻毒组和试验Ⅰ～Ⅲ组,每组5个重复(n=5)。对照组和攻毒组饲喂基础饲粮,试验Ⅰ～Ⅲ组按照0.5%、1.0%和1.5%水平添加复方中草药制剂,基础饲粮配方及营养成分参考靳二辉等研究。30日龄时,攻毒组和试验Ⅰ～Ⅲ组青脚麻鸡采用点眼法进行IBDV攻毒,每羽点眼剂量为0.15 mL,试验期7 d。动物自由饮水,自由采食,按照肉鸡饲养管理指南进行日常管理和免疫接种(不接种IBD疫苗),对照组、攻毒组和试验Ⅰ～Ⅲ组除饲粮不同外,其他条件均保持一致。

1.4 样品采集和处理

分别在攻毒后3和7 d,随机每组挑选10(每个重复2羽)羽青脚麻鸡禁食不禁水12 h。称重后处死,分离胸腺,一部分固定于4%的PFA,另一部分经液氮冷冻后在-80 ℃保存。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 胸腺器官指数和显微结构观察 分离胸腺,称重,计算胸腺指数。胸腺组织在4%PFA中室温固定72 h后,按照石蜡切片常规制作方法,制作石蜡切片,HE 染色,全自动显微数码切片扫描系统进行扫描、观察和拍照(VMV1,MOTIC公司)。

1.5.2 胸腺细胞因子测定 胸腺组织通过低温匀浆,离心分离上清,-20 ℃保存。测定时,胸腺组织上清放至室温融化后,使用ELISA试剂盒(R&D Systems Inc,USA)按照操作说明测定IL-2、IL-4和INF-γ吸光值,利用对应标准曲线计算IL-2、IL-4和INF-γ含量,对应标准曲线相关系数分别为0.992 5、0.994 3和 0.994 2。

1.5.3 胸腺凋亡相关基因表达测定 胸腺组织经液氮研磨,按照RNA提取试剂盒(天根,DP431)说明书提取总RNA。全自动超微量核酸蛋白分析仪测定总RNA浓度,反转录试剂盒(Thermo,K1622)合成cDNA。按照实时荧光定量PCR试剂盒(RR420A,大连宝生物)说明书进行PCR扩增(Roche LightCycler 480II,瑞士)。实时荧光定量PCR扩增引物序列见表1。扩增结果以 2-CT公式进行计算。

表1 Caspase-3基因扩增引物序列

1.5.4 胸腺凋亡相关蛋白表达测定 称取胸腺组织0.1 g,在液氮中研磨,按照常规Westernblot操作步骤进行蛋白表达测定。借助FluorChem HD2全自动曝光仪进行曝光,得到条带后用Quanity One分析条带光密度值。

1.5.5 胸腺Caspase-3阳性细胞定位和分布 参照施洪峰的免疫组化方法观察Caspase-3阳性细胞定位和分布。每张阳性切片分别均匀选取5个视野,采用Image Pro Plus 6软件统计测量胸腺组织中Caspase-3阳性细胞数。

1.6 数据统计分析

试验数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析,采用LSD多重比较分析分析各处理组试验数据均值的差异性,以

P

<0.05作为显著性判断标准。所有试验数据均用平均数±标准差(X±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 胸腺指数

由图1可知,与对照相比,IBDV攻毒第3天,攻毒组青脚麻鸡胸腺指数显著升高23.64%(

P

<0.05),而试验Ⅱ组青脚麻鸡胸腺器官指数相比攻毒组显著降低32.35%(

P

<0.05),其他试验组则无明显变化(

P

>0.05)。与对照组相比,IBDV攻毒第7天,攻毒组、试验Ⅰ和Ⅲ组试青脚麻鸡胸腺指数分别显著升高26.92%、23.08%和19.23%(

P

<0.05),而试验Ⅱ组青脚麻鸡胸腺器官指数相比攻毒组显著降低10.61%(

P

<0.05)。

图1 复方中草药制剂对感染IBDV青脚麻鸡胸腺指数的影响(n=10)

2.2 胸腺显微结构

由图2可知,IBDV攻毒第3天,对照组胸腺显微结构正常,皮质厚度适中,皮质和髓质比例适当(图2A)。与对照组相比,攻毒组胸腺显微结构受损,皮质厚度明显降低,其内淋巴细胞排列疏松,髓质面积明显增大,其内淋巴细胞排列疏松,胸腺小体数量减少,皮质和髓质中均出现空泡样结构(图2C)。试验Ⅰ组胸腺显微结构也呈现一定程度损伤,皮质厚度降低,髓质内出现空泡样结构,皮质和髓质比例减小,胸腺细胞排列疏松(图2E)。试验Ⅱ组胸腺结构基本正常,胸腺皮质厚度无显著变化,其内胸腺细胞排列紧密,髓质内胸腺小体数量有所增加(图2G)。试验Ⅲ组胸腺小叶变小,皮质厚度有所降低,皮质和髓质内胸腺细胞排列疏松,髓质内胸腺小体数量较多(图2I)。IBDV攻毒第7天,对照组胸腺显微结构正常,皮质厚度较3d时有所降低,皮质和髓质比例减小,髓质内胸腺小体数量有所增加(图2B)。与对照组相比,攻毒组胸腺结构仍呈现明显损伤,皮质厚度明显降低,皮质和髓质内胸腺细胞数量减少,髓质内毛细血管淤血,胸腺小体数量明显减少(图2D)。试验Ⅰ～Ⅲ组胸腺显微结构基本恢复正常,皮质厚度明显增加,髓质面积减小,皮质和髓质内胸腺细胞数量增多,胸腺小体数量也逐渐增加,空泡样结构消失(图2F、2H和2J)。

图2 复方中草药制剂对感染IBDV青脚麻鸡胸腺组织结构的影响

由图3可知,与对照组相比,IBDV攻毒第3天,攻毒组青脚麻鸡胸腺皮质厚度显著降低22.16%(

P

<0.05),而试验Ⅱ、Ⅲ组青脚麻鸡胸腺皮质厚度相比攻毒组分别显著升高21.96%和9.05%(

P

<0.05),但试验Ⅰ组无显著变化(

P

>0.05)。与对照组相比,IBDV攻毒第7天,攻毒组青脚麻鸡胸腺皮质厚度显著降低13.57%(

P

<0.05),而试验Ⅰ～Ⅲ组青脚麻鸡胸腺皮质厚度相比攻毒组分别显著升高13.01%、16.12%和15.49%(

P

<0.05)。

图3 复方中草药制剂对感染IBDV青脚麻鸡胸腺组织学参数的影响

2.3 胸腺细胞因子含量

由表2可知,与对照组相比,IBDV攻毒第3天,攻毒组青脚麻鸡胸腺IL-2、INF-γ含量分别显著降低11.03%、16.58%(

P

<0.05),而胸腺IL-4含量显著升高16.04%;相比攻毒组,试验Ⅱ、Ⅲ组胸腺IL-2含量分别显著升高14.04%、14.21%(

P

<0.05),试验Ⅱ、Ⅲ组胸腺IL-4含量分别显著降低10.19%、16.18%(

P

<0.05)。与对照组相比,IBDV攻毒第7天,攻毒组青脚麻鸡胸腺IL-2、INF-γ含量分别显著降低9.98%、9.07%(

P

<0.05),而胸腺IL-4含量无显著变化(

P

>0.05);相比较于攻毒组,试验Ⅱ、Ⅲ组胸腺IL-2含量分别显著升高9.95%、13.70%(

P

<0.05),试验Ⅱ组胸腺INF-γ含量显著升高7.11%(

P

<0.05),而其他试验组均无显著变化(

P

>0.05)。

表2 复方中草药制剂对感染IBDV青脚麻鸡胸腺细胞因子的影响

2.4 胸腺Caspase-3 mRNA和蛋白表达

由图4可知,与对照组相比,IBDV攻毒第3天,攻毒组青脚麻鸡胸腺Caspase-3 mRNA和蛋白表达分别显著升高71.79%和183.33%(

P

<0.05);相比较攻毒组,所有试验组Caspase-3 mRNA表达量分别显著降低28.35%、29.95%和31.34%(

P

<0.05);Caspase-3蛋白表达量也分别显著降低51.01%、50.00%和47.05%(

P

<0.05)。与对照组相比,IBDV攻毒第7天,攻毒组青脚麻鸡胸腺Caspase-3 mRNA相对表达量显著升高19.05%(

P

<0.05),而蛋白表达量无显著变化(

P

>0.05);相比较攻毒组,所有试验组Caspase-3 mRNA相对表达量分别显著降低20.12%、8.25%和22.31%(

P

<0.05),而所有试验组Caspase-3蛋白表达量均无明显变化(

P

>0.05)。

图4 感染IBDV青脚麻鸡胸腺Caspase-3 mRNA和蛋白表达

2.5 胸腺Caspase-3阳性细胞定位与分布

由图5可知,胸腺Caspase-3+细胞呈棕褐色,胞质中出现较多的棕褐色阳性颗粒,主要分布在胸腺皮质内,髓质内仅有较少的Caspase-3+细胞。IBDV攻毒第3和7天时,对照组胸腺Capsase-3+细胞数量较少,分布均匀,主要分散在胸腺皮质的边缘(图5A和5B)。与对照组相比,攻毒组胸腺Caspase-3+细胞数量显著增加,分布明显增大,皮质的边缘和深层均分布较多的Caspase-3+细胞,甚至在髓质内也呈现明显的增多现象(图5C和5D)。IBDV攻毒第3天时,试验Ⅰ组胸腺Caspase-3+细胞数量仍明显较多,分布范围仍明显较大,与攻毒组相比无显著差异(图5E)。IBDV攻毒第7天时,试验Ⅰ组胸腺Caspase-3+细胞数量和分布无显著差异(图5F)。IBDV攻毒第3和7天时,试验Ⅱ和Ⅲ组胸腺Caspase-3+细胞数量有所增多,分布范围增大,但差异均不明显(图5G、5H、5I和5J)。

图5 复方中草药制剂对感染IBDV青脚麻鸡胸腺Caspase-3+细胞分布的影响

由图6可知,与对照组相比,IBDV攻毒第3天,攻毒组青脚麻鸡胸腺单位面积Caspase-3阳性细胞数显著增加33.86%(

P

<0.05);相比较攻毒组,试验Ⅱ组单位面积Caspase-3阳性细胞数显著减少21.14%(

P

<0.05)。与对照组相比,IBDV攻毒第7天,攻毒组青脚麻鸡胸腺单位面积Caspase-3阳性细胞数显著增加26.09%(

P

<0.05);相比较攻毒组,试验Ⅰ～Ⅲ组单位面积Caspase-3阳性细胞数分别显著减少20.63%、22.21%和27.24%(

P

<0.05)。

图6 复方中草药制剂对感染IBDV青脚麻鸡胸腺Caspase-3+细胞数的影响

3 结论与讨论

3.1 复方中草药制剂对IBDV感染青脚麻鸡胸腺显微结构的影响

IBDV是一种无包膜的双RNA病毒,其主要侵害禽类法氏囊,但研究发现,IBDV还能够损坏机体免疫活性细胞功能,造成胸腺和脾脏等免疫器官显微结构损伤,功能抑制,进而导致动物整体免疫功能下降,引发免疫抑制。本试验发现,感染IBDV第3天,攻毒组青脚麻鸡出现了明显临床症状,表现精神沉闷,拉白色稀粪,胸腺指数显著升高,显微结构出现明细病理变化,皮质厚度显著降低,其内淋巴细胞排列疏松,胸腺小体数量减少,皮质和髓质中均出现空泡样结构。然而,饲料中添加1.0%的复方中草药制剂能够显著降低IBDV感染3和7 d青脚麻鸡的胸腺指数,胸腺显微结构明显改善,这表明饲粮添加1.0%复方中草药制剂可以改善IBDV对青脚麻鸡胸腺显微结构和生长发育的损失,进而增强胸腺免疫功能。分析其主要原因可能是,本试验所用的复方中草药制剂中总多糖成分高达1.85%,而大量研究表明,中草药中的多糖成分能够增加正常肉鸡胸腺指数,产生明显的抗衰老、抗炎、抗菌功能。但是,本试验也发现,饲粮中添加1.5%的复方中草药制剂没有显著降低IBDV感染3和7 d青脚麻鸡的胸腺指数,其主要原因可能是1.5%的复方中草药添加剂量造成青脚麻鸡饲料配方中能量和蛋白含量减少,鸡只摄入的营养物质总量也减少,最终影响了复方中草药直接免疫增强消化的发挥。

3.2 复方中草药制剂对IBDV感染青脚麻鸡胸腺细胞因子分泌的影响

动物机体发挥特异性免疫要依赖于T和B淋巴细胞来实现,其中T淋巴细胞是实现细胞免疫功能的关键。根据T细胞表面抗原和受体可将T细胞分为辅助性T细胞(Th)、抑制性T细胞(Ts)、效应T细胞(Te)等。而CD4+T 淋巴细胞是辅助性T淋巴细胞,根据其分泌细胞因子的种类,可分为Th0、Th1、Th2和Th3亚型,其中Th1型主要分泌IL-2、INF-γ等,Th2型细胞主要分泌IL-4、IL-6等,这两种细胞因子含量能够直接反映出机体T淋巴细胞免疫功能状态。周凌博等研究结果显示,饲喂雪峰乌骨鸡复方中草药制剂(由黄芪、甘草、白术、丹参、淫羊藿组成),可显著提高鸡血清中IL-2、IL-6和IFN-γ以及IgG和IgA的含量。靳二辉等添加1.0%和1.5%中草药复方制剂超微粉可显著提高28和56 d青脚麻鸡法氏囊INF-γ,IL-2及IBDV抗体含量,增强法氏囊免疫功能。徐泊文等研究表明,灌胃小鼠味宣肺透解剂(由黄连、薄荷、荆芥等中草药组成)能够明显提高流感病毒感染小鼠血清IL-2和INF-γ水平,增强小鼠免疫力。本研究也发现,在饲粮中添加1.0%和1.5%的复方中草药制剂在一定程度上可以增加IBDV感染3和7 d青脚麻鸡鸡胸腺IL-2和INF-γ含量,其中以添加1.0%效果最佳,这是由于本试验所用的复方中草药制剂中不仅含有丰富的营养物质,而且还有清热解毒的功效,能够促进淋巴细胞增殖,增加CD4T细胞亚群比例,进而促进细胞因子IFN-γ和IL-2分泌,而且复方制剂中的黄连能够促进营养物质的消化吸收和利用,为淋巴细胞增殖提供充足的营养,促进淋巴细胞分泌细胞因子。

3.3 复方中草药制剂对IBDV 感染青脚麻鸡胸腺细胞增殖凋亡的影响

许多研究证实,中草药及其提取物能够影响Caspase-3表达,从而抑制细胞凋亡。杨巧红等研究发现,给胸腺急剧萎缩的小鼠注射黄芪注射液,可抑制小鼠胸腺淋巴细胞凋亡和Caspase-3蛋白表达,增强胸腺免疫功能。周金星等研究发现,按体重3.0 mL/kg剂量灌胃SD大鼠复方中草药制剂(由炒白术、板蓝根、黄芪、山楂、甘草等组成),使得SD大鼠Caspase-3阳性细胞面积显著减少,Caspase-3蛋白表达被明显抑制。孙雨豪等研究表明,在饲粮中添加1.0%复方中草药制剂(由金银花、甘草、黄芪、黄连等组成)能够显著降低IBDV感染青脚麻鸡脾脏Caspase-3阳性细胞数,抑制Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达,减轻IBDV对脾脏细胞凋亡的损伤。Li等研究发现,黄芩苷能够抑制支原体诱导鸡败血的症胸腺组织中凋亡相关基因Caspase-3的表达,进而减轻胸腺组织损伤。靳二辉等前期研究也证实,饲粮中添加1.0%和1.5%中草药复方制剂(主要由金银花、蒲公英、黄连组成)可使28和56 d青脚麻鸡法氏囊Caspase-3阳性细胞数量显著减少,降低Caspase-3蛋白的相对表达量。本研究发现,在饲粮中添加不同剂量的复方中草药制剂均能够显著降低IBDV感染3和7 d青脚麻鸡胸腺Caspase-3 mRNA相对表达以及感染7 d胸腺单位面积Caspase-3阳性细胞数量。而且,在饲粮中添加1.0%的复方中草药制剂可显著降低IBDV感染3和7 d青脚麻鸡胸腺Caspase-3蛋白表达和单位面积阳性细胞数,这与前人研究一致,表明本研究所用复方中草药制剂能够显著抑制Caspase-3 基因和蛋白表达,减弱IBDV对胸腺细胞凋亡的损伤。分析其主要原因可能是,本试验所用复方中草药制剂中富含黄连素和绿原酸等可抑制细胞凋亡的有效成分。研究证实,黄连素可促进胃癌细胞凋亡,而绿原酸则可抑制正常细胞凋亡相关蛋白表达,能够阻止体外因素诱导的动物机体细胞凋亡。以上研究充分表明,饲粮添加1.0%复方中草药制剂能够减轻IBDV感染对青脚麻鸡胸腺显微结构的损伤,促进细胞因子的分泌,抑制Caspase-3 mRNA和蛋白的表达,增强青脚麻鸡胸腺免疫功能,但其通过何种途径影响IBDV感染青脚麻鸡胸腺相关功能仍不清楚,这需要进一步研究阐明。

综上,饲粮添加由金银花、黄芪、蒲公英、熟地黄、甘草、黄连等中药制成的复方中草药制剂能够不同程度改善IBDV感染青脚麻鸡胸腺显微组织结构,增强免疫功能,抑制Caspase-3 mRNA和蛋白的相对表达,减轻IBDV对青脚麻鸡胸腺的损伤作用,其中以1.0%添加量效果最佳。