唐靖雯， 钱晶晶， 邓绘子， 马 丹， 郭建溱， 李乡春， 张雪平

(安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100)

球兰属于蔓性草本，该属植物广泛分布于热带亚热带，有350～450种，在我国主要分布于云南、广东、台湾。花序的形状独特，色泽宜人，有着较高的观赏价值，很受人们喜爱。目前随我国花卉市场不断扩大，球兰引进及自主培育种类、生产数量逐年呈增长趋势，在花卉市场上常见到不同种类的球兰。

国内对球兰的繁殖多采用扦插等传统方法。赖碧丹等概述了球兰的扦插、压条等育苗技术。马斯婷等研究了球兰不同的插穗种类在5种基质中的生根情况。在生产中，球兰扦插繁殖时，插穗生根和生长较慢。植物组织培养技术可以快速获取优良植物株系，为球兰繁育提供了一些新的思路以及方法。管艳等对心叶球兰进行组织培养与快繁试验。对球兰离体再生体系建立的研究鲜见报道。

本试验探究不同激素配比对球兰叶片愈伤组织增殖、分化和丛生芽诱导及促根的影响，建立球兰离体再生体系，以期为球兰高效无菌繁育体系的建立及种质离体保存提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

滁州市菁萃园艺提供的自主选育的球兰品种，种子发芽的无菌苗为外植体材料。

1.2 试验步骤及方法

1.2.1 培养基的配制以及无菌系的建立 配制MS培养基，分装和灭菌，冷却待用。将球兰种子放入纱布中包扎，用自来水边冲边洗10 min后，转移至超净工作台上。先用酒精浸泡再用无菌水冲洗3～4次，接着用0.1% HgCl2浸泡10～15 min，无菌水冲洗3～4次，接种于MS培养基中，平均每瓶接入3～4粒种子，置于培养室内：温度在23～27℃，光照1 500～2 000 lx，15 d后，发芽待用。

1.2.2 外植体愈伤组织诱导 选取生长健壮，长势一致的植株，以叶片为外植体进行诱导愈伤组织，将叶片切成1 cm的小块，分别接种于以下8种不同激素配比的培养基上：A：0.5 mg/L NAA；B：1.0 mg/L NAA；C：0.5mg/L 2,4-D；D：1.0 mg/L 2,4-D；E：(0.5 mg/L 6-BA)+(0.5 mg/L NAA)；F：(0.5 mg/L 6-BA)+(1.0 mg/L NAA)；G：(0.5 mg/L 6-BA)+(0.5 mg/L 2,4-D)；H：(0.5 mg/L 6-BA)+(1.0 mg/L 2,4-D)。每瓶接入外植体3～4个，36 d后观察记录并计算诱导率。

1.2.3 愈伤组织增殖培养 选取生长状况较好的愈伤组织，将其切成0.5 cm的小块，分别接种于以下4种不同的培养基:(1.0 mg/L 6-BA)+(0.05 mg/L IBA)；(1.0 mg/L 6-BA)+(0.1 mg/L IBA)；(1.0 mg/L 6-BA)+(0.2 mg/L IAA)；(1.0 mg/L 6-BA)+(0.5 mg/L IAA)。每瓶接入3～4块，60 d后观察记录并计算增殖率。

1.2.4 丛芽诱导 选取愈伤组织生长状况较好的，将其切成0.5 cm的小块，分别接种于以下7种不同激素配比的培养基：1.0 mg/L 6-BA；(1.5 mg/L 6-BA)+(0.5 mg/L NAA)；(1.5 mg/L 6-BA)+(1.0 mg/L NAA)；(2.0 mg/L 6-BA)+(1.0 mg/L NAA)；2.0 mg/L 6-BA；0.5 mg/L 6-BA；0 mg/L。每瓶接入3～4块，60 d后观察记录并计算丛芽诱导率。

1.2.5 生根培养 在生长90 d的丛生芽中，选择生长较好的，转接于以下3种不同的培养基:MS；MS+(0.1 mg/L NAA)；MS+(0.5 mg/L IAA)。每瓶接入无菌苗4株，60 d后观察记录并计算生根率。

2 结果与分析

2.1 不同激素组合对诱导愈伤组织的影响

为了分析不同激素对诱导愈伤组织的影响,设计了8组试验，详见图1～2。

图1 不同激素组合对诱导愈伤组织的影响

图2 不同激素组合对诱导愈伤组织的影响

为了分析出不同激素对诱导愈伤组织的影响，设计了8组试验，愈伤率为100.00%的有2个，分别是配方E和F，配方H为33.00%。配方E在与配方A加入相同0.5 mg/L NAA的前提下，加入了0.5 mg/L 6-BA，其愈伤率比配方A增加了58.50%。配方B加入1.0 mg/L NAA，在与其相同的前提下，配方F加入了0.5 mg/L 6-BA，其愈伤率比配方B增加了50.00%。可知诱导愈伤组织，6-BA有着至关重要的作用。在均为0.5 mg/L 6-BA时，配方E加入0.5 mg/L NAA，配方G加入0.5 mg/L 2,4-D，配方E愈伤率比配方G增加了37.50%。在同样加入0.5 mg/L 6-BA的条件下，配方F加入了1.0 mg/L NAA，而配方H加入1.0 mg/L 2,4-D，配方F愈伤率比配方H增加了67.00%，初步可以得出在诱导愈伤组织中NAA也非常重要。在不加其它激素的情况下，配方A和B分别加入0.5、1.0 mg/L NAA，均有利于促进其生根。从配方C、D、G和H的愈伤组织中，可以看出愈伤组织生长正常，其前提是6-BA、2,4-D的比例接近1。配方E和F在一定配比浓度的6-BA、NAA有利于球兰叶片愈伤的形成，最佳比例在6-BA、NAA的比例接近1，其愈伤效果较好，愈伤为浅绿色。

2.2 不同激素组合对愈伤组织增殖培养的影响

为了分析不同激素对愈伤组织增殖的影响,设计了4组试验,详见图3～4。

图3 不同激素组合对愈伤组织增殖培养的影响

为了分析出不同激素对愈伤组织增殖的影响，设计了4组试验，增殖率为100.00%的是配方C，配方A为33.50%。配方C、A均加入1.0 mg/L 6-BA，配方C加入0.2 mg/L IAA，配方A加入IBA 0.05 mg/L，配方C增殖率比配方A增加了66.50%。在均加入1.0 mg/L 6-BA的前提下，配方D加入了0.5 mg/L IAA，而配方B加入了0.1 mg/L IBA，配方D增殖率比其增加了50.00%。可知，要使愈伤组织增殖效果较佳，需加入6-BA和IAA。配方C、D均加入1.0 mg/L 6-BA的前提下，配方C加入了0.2 mg/L IAA，而配方D加入了0.5 mg/L IAA，其配方C的增殖率比其增加了16.50%。即增殖与6-BA、IAA的一定比例相关。从图4可以看出，配方C和配方A的愈伤组织一种是增殖率最高的绿色紧密的组织，另一种是增殖效果不佳的组织。

图4 不同激素组合对愈伤组织增殖培养的影响

2.3 不同激素组合对丛芽诱导的影响

为了分析出不同激素对丛芽诱导的影响,设计了7组试验，详见图5～6。

图5 不同激素组合对丛芽诱导的影响

为了分析出不同激素对丛芽诱导的影响，设计了7组试验，诱导率为100.00%的是配方C，配方F最低，为8.30%(图5)。配方E与F相比，在都不加入NAA的前提下，配方E加入了2.0 mg/L 6-BA，而配方F加入了0.5 mg/L 6-BA，诱导率比配方F增加了2.70%。配方B、C均加入1.5 mg/L 6-BA，配方B加入了0.5 mg/L NAA，而配方C加入了1.0 mg/L NAA，配方C诱导率比其增加了59.00%。配方C、D均加入1.0 mg/L NAA的前提下，配方C加入了1.5 mg/L6-BA，另一个加入2.0 mg/L 6-BA，其诱导率比另一个增加了17.00%。试验结果表明:在试验中丛生芽诱导效果，与6-BA和NAA的比例相关，以3∶2为宜。诱导率较高的是配方C，其丛生芽的颜色是绿色；而生长状况不佳且长势弱小的是配方F(图6)。

图6 不同激素组合对丛芽诱导的影响

2.4 不同激素组合对生根的影响

为了分析出不同激素对生根的影响,设计了3组试验。

为了分析出不同激素对生根的影响，设计了3组试验，配方B的生根率最高，为97.22%；配方A最低，为60.22%(表1)。配方A在不加任何激素的前提下，其生根效果不佳；配方B加入的激素与配方C不一样，但生根率比配方C增加了2.78%，配方B生长出来的根细长，而且分化能力强(图7)。可得出：球兰的生根需要适宜浓度的NAA。

表1 不同激素组合对生根的影响

图7 不同激素组合对生根的影响

3 结论与讨论

3.1 NAA、2,4-D与6-BA的不同比例对诱导愈伤组织的影响

在探讨诱导愈伤组织试验中发现,激素的种类以及浓度对试验有着不同的影响。在该试验中,以无菌苗叶片为外植体,接入到不同激素组合的培养瓶中,之所以选择无菌苗叶片,是因为在组织培养过程中要选择健康的材料以降低污染率。30 d后观察记录,得出适宜浓度的6-BA和NAA更有利于诱导愈伤组织,其愈伤组织为浅绿色。研究发现,在植物组织培养中,既要考虑激素的使用浓度也要掌握好激素之间的比例问题。要想诱导愈伤组织效果较佳,6-BA和NAA应在适宜比例下,这与余慧等得出的结论相似。一定浓度的NAA对愈伤组织生根有积极地作用。试验发现,所诱导的愈伤组织不仅有绿色紧密的还有黄色疏松的。6-BA和NAA的比例在1∶1时,愈伤组织为绿色紧密的小颗粒组织,具有分化为根或芽的能力。通过本次试验,初步得出适宜诱导愈伤组织的激素配比。

3.2 IBA与IAA的不同比例对愈伤组织增殖的影响

通过试验发现,影响球兰愈伤组织增殖率的因素有愈伤组织生长速度等。在该试验中,以生长较好的绿色愈伤组织为外植体,接入到不同激素组合的培养瓶中,30 d 后观察记录,得出在一定浓度6-BA的前提下,IAA更适合愈伤组织增殖,增殖较好,紧致。已有研究表明,在愈伤组织增殖培养中,将生长素与细胞分裂素结合对其有促进作用。因此,6-BA、IAA在适宜比例时,对愈伤组织增殖有着较为积极的作用。在整个试验中,愈伤组织的增殖和分化是很关键的。本试验是探讨在6-BA相同的前提下,不同浓度的生长素对愈伤组织增殖是否有影响。通过试验初步得出,加入一定浓度的IAA愈伤组织增殖效果较好。本试验通过探讨IBA与IAA的不同比例对愈伤组织增殖的影响,初步得出适宜愈伤组织增殖的激素配比。

3.3 NAA与6-BA的不同比例对诱导丛生芽的影响

NAA与6-BA共同作用对于诱导不定芽的分化和生长有着积极地作用。通常认为,6-BA和NAA比值小会促根,反之则促芽。但是,NAA的浓度过高不利于芽的生长,过低会导致生长较慢,这就要求在试验时要控制好它的浓度。一定浓度的生长素也很重要,但球兰自身容易生根,因此,在诱导丛生芽时,6-BA的浓度应适当偏高,而只添加6-BA的分化培养基中不能诱导出不定芽,而当6-BA和NAA组合使用时,可以分化出一定数量的再生芽。这与何朋等研究结论相似。本试验通过探讨NAA与6-BA的不同比例对诱导丛生芽的影响,初步得出适宜丛生芽生长的激素配比。

3.4 NAA与IAA的不同比例对生根的影响

在该试验中,以丛芽为外植体,接入到不同激素组合的培养瓶中,30 d 后观察记录,得出一定浓度的NAA更有利于丛生芽生根,其植株生长旺盛且为绿色,根细长,分化能力强。但要控制NAA的浓度,因为过低或过高会影响其生根效果。另外通过试验还观察到,除了发现植株基部生根外,还产生了少量的浅绿色愈伤组织。在生根时,要想效果较佳,应加入一定浓度的生长素。试验结果表明:要想促进植株生长可以加入适宜浓度的IAA,促进生根可以加入适宜浓度的NAA。通过试验可知,要想促进球兰生根离不开生长激素,这与庾韦花等对“桂冬1号”天门冬再生体系的建立得出的结论相似。本试验通过探讨NAA与IAA的不同比例对生根的影响,初步得出适宜生根的激素配比。

综上所述,从试验的数据分析可以得出,一定浓度的6-BA和NAA有利于球兰叶片愈伤的形成,最佳比例在6-BA、NAA的比例接近1时,其愈伤效果较好,愈伤为浅绿色,最佳培养基为:MS+(0.5 mg/L 6-BA)+(1.0 mg/L NAA)+(6.0 g/L琼脂)+(30 g/L蔗糖)。进一步试验,通过在6-BA相同的情况下,不同浓度的IBA、IAA配比,得出愈伤组织增殖培养的最佳培养基为:MS+(1.0 mg/L 6-BA)+(0.2 mg/L IAA)+(6.0 g/L琼脂)+(30 g/L蔗糖)。通过探讨不同激素对丛芽诱导的影响,得出丛芽诱导的最佳培养基为:MS+(1.5 mg/L 6-BA)+(1.0 mg/L NAA)+(6.0 g/L琼脂)+(30 g/L蔗糖)。通过探讨不同激素对球兰生根的影响,在加入一定浓度的NAA、IAA以及不加任何激素的3种条件下,只有在MS+(0.1 mg/L NAA)+(6.0 g/L琼脂)+(30 g/L蔗糖)的培养基中,对其生根有着一定的促进作用。本试验为球兰无菌系的建立,实现研究球兰种质离体保存条件提供了有效依据。