唐 益，周 林，周宇鑫，刘 丽，赵璟璐，宫晓庆，迟长凤

(浙江海洋大学海洋科学与技术学院，国家海洋设施养殖工程技术研究中心，海洋生物种质发掘与利用国家地方联合实验室，浙江舟山 316022)

精子相关蛋白是一大类与精子发生和形成、精卵识别以及顶体反应等受精活动密切相关的蛋白。MARTINES-HEREDIA，et al[1]利用双向凝胶电泳结合离子质谱对人精子细胞进行了蛋白质组学分析，并根据这些蛋白在生理过程中所起的具体作用将其分为多种类型，包括与能量产生有关的蛋白，与mRNA 转录相关的蛋白，与蛋白质在体内的合成、转运以及结构折叠有关的蛋白，与信号转导有关的蛋白，与细胞骨架的形成有关的蛋白，与鞭毛的形成以及细胞运动有关的蛋白，甚至还包括很多未知功能的蛋白。随着科技的进步，随着各种分离纯化、克隆、定位研究方法与技术的发展，使我们能够在更深层面对于这一类生物因子的生理功能以及作用机理有更加深入的认识。

1 精子表面蛋白17

精子表面蛋白17(Sp17)最早是在兔精子中被发现的[2]，被认为参与了精子的顶体反应，是受精过程中的关键分子。而精子鞭毛蛋白最初定位于精子鞭毛鞘中，相关研究认为它可能参与了精子尾部鞭毛结构的形成以及功能。截至目前，众多学者针对它们进行了结构、表达、定位以及功能方面的研究，并取得了丰富的成果。

1.1 理化性质

1994 年RICHARDSON，et al[2]首次在兔精子中发现了Sp17的存在，通过G22C 抗体实验证明，Sp17 最早出现在顶体反应开始之后，并利用重组蛋白rSp17 在体外受精的实验证明Sp17 能够结合卵膜透明带以及葡聚糖和硫酸葡聚糖。LEA，et al[3]克隆了人Sp17 基因的cDNA 全长，通过对编码的氨基酸序列分析，发现它不含信号肽，没有跨膜结构。WEN Ying，et al[4]利用免疫共沉淀的方法研究发现，在精子细胞完成获能过程直至发生顶体反应之前，从兔精巢中分离得到的Sp17 在泳道中呈现出由22～24 kDa 大小不同的三种蛋白构成的蛋白三联体，这样的结果与RICHARDSON，et al[2]以及LEA，et al[3]通过SDS-PAGE 电泳得到的结果类似。然而，一旦对完成了获能的精子细胞施以钙离子刺激，其Sp17 氨基酸序列的C 端就会剪切掉部分序列，主要包括钙调蛋白结合位点即IQ 结构域序列，从而产生大小为17～19 kDa的三联体蛋白，并且随着这种刺激作用的持续，分子量较大的三联体蛋白数量逐渐减少，而同时分子量较小的三联体蛋白数量逐渐增加。

LEA，et al[5]发现，Sp17 作为一种抗原在输精管切除术后男性体内迅速增多，并证明了Sp17 蛋白表面存在2 个免疫显性线性B 细胞抗原表位，这一点与重组蛋白HSp17 在体内的表达是不同的。ADOYO，et al[6]克隆得到了狒狒SP17cDNA 全长序列，并在体内发现了多种长度为0.8～1.35 kD的cDNA 序列，它们在3’非编码区(UTR)存在差异，均编码长度为163 个氨基酸的蛋白质，跟人的相似度达到97%，仅在靠近C 端的12 个氨基酸上存在不同。针对不同物种的Sp17 结构域分析发现，该蛋白中靠近N 端位置含有高度保守的DD CABYR SP17 结构域以及分布于靠近C 端位置的一个或多个IQ 结构域[7]，因此，Sp17 属于钙调素结合蛋白家族[8]。此外，其N 端的部分氨基酸序列在很大程度上跟CAMP 蛋白激酶A 调节亚基(PKA RII)高度相似[9]，氨基酸二级结构分析发现位于IQ 结构域内的氨基酸含有丰富的螺旋结构，这也预示着钙调素与钙调蛋白结合域中的α-螺旋结构的稳定可能具有某种天然的联系[10-11]。而且不同物种Sp17 氨基酸链上均存在PEST 序列，进一步分析发现在其他含有钙调蛋白结合域的蛋白质中也存在这样的结构[12]。

1.2 组织表达特异性及生物学功能

O'RAND，et al[13-14]通过重组蛋白的实验证明，Sp17 可以与雌兔卵膜透明带上的糖蛋白R45 或者R55结合，因此，推测Sp17 可能作为结合透明带表面糖基的分子而参与到顶体反应中，并促进受精作用。ADOYO，et al[6]通过Northern blot的方法确定了Sp17 在精巢中特异性表达，并利用细胞免疫的方法证明Sp17 主要分布于精母细胞、精子以及生精上皮组织中。然而CHIRIVA-INTERNATI，et al[15]通过人体免疫学研究发现Sp17 不仅在雄性生殖系统中表达，在其它正常的组织中也会有微量表达，尤其在呼吸系统特别是纤毛细胞中有较高的表达量[16]。

CAMP 结构中的PKA RII 是形成蛋白二聚化以及与蛋白激酶A 锚定蛋白(AKAPs)相互作用所必需的[17]。SP17 中N 端与之高度相似的氨基酸序列可能具有类似的作用。PEST 序列是一段含有丰富的脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸组成的短序列，长度大约为10 个氨基酸残基，被证明与泛素化降解有关[18]，而SP17氨基酸链上的PEST 序列可能与顶体反应中高分子量的Sp17 蛋白被剪切掉C 端的部分序列以及钙调素结合位点而最终呈现出小分子量的蛋白增加现象有关。

近年来针对Sp17的研究发现，相比于在普通正常组织中表达量极低甚至不表达，该基因在一些多发性骨髓瘤[19]以及卵巢癌细胞[20]中也具有大量表达，这一新的发现也打破了以往人们认为的Sp17 只能在雄性个体中精子不同形成阶段发挥作用的认识。Sp17 基因的这一特点使其具有作为理想靶点的先决条件，为现代医学中的靶向治疗提供了明确的方向[21]。Sp17 在人体中的组织表达特异性分析表明，通常情况下Sp17 在女性体内正常组织中表达量极低，而在病变的卵巢癌组织中表达量很高，因此，曹王丽等[22]制备了高特异性抗Sp17的单克隆抗体3C12，成功用于卵巢癌抗肿瘤药物的研究。而李芳秋等[23]通过RT-PCR 技术对大量肿瘤样本的检测发现，SP17的mRNA 在原发性卵巢癌组织中的检出率高达84.5%，而不同来源的肿瘤组织中Sp17的表达量差异可能作为判断卵巢癌组织来源的重要标志[24]。张春华等[25]在针对不孕症的研究中发现这类男性的血清中存在抗Sp17 抗体，并认为它可以作为一种辅助诊断的指标用于医学检测，同时也说明Sp17的自身抗原性使其可能作为避孕疫苗的候选抗原而在避孕过程中发挥作用。张巧玉等[26]在实验中利用重组Sp17 蛋白在小鼠体内获得了高效特异性的表达，并获得了具有一定生物活性的表达产物，这一研究成果为人类避孕药的开发提供了一定的理论基础。

2 精子鞭毛蛋白

2.1 理化性质

精子鞭毛蛋白1 和精子鞭毛蛋白2 同属于精子鞭毛蛋白家族，被认为与精子鞭毛结构的形成有关。Spef1最初是在老鼠的2 号染色体上某个含有Cenpb[27]以及Cdc25C[28]基因的区域内被发现的。CHAN，et al[29]利用Northern 印记杂交显示在小鼠体内存在不同长度的Spef1mRNA，克隆得到的两种Spef1 cDNA 序列，均能编码长度为234 个氨基酸，相对分子量约为27kDa的蛋白。通过进一步研究发现，Spef1的cDNA 在其3’UTR 区存在不同的转录起始位点，由此说明在较长的cDNA 分子中可能存在着可变的多腺苷酸化位点。此外，其氨基酸序列中还存在多个潜在的磷酸化以及糖基化位点，并在107-110 号氨基酸处存在潜在的核定位信号位点。

基于大量的精子鞭毛蛋白同源蛋白分析发现，根据其序列的保守性差异可以将这类蛋白区分为两种类型，即Spef1 和Spef2，它们之间唯一的区别就是，Spef2 氨基酸序列中位于羧基末端的40 个氨基酸残基在进化中极不保守，而且Spef2 主要在脊索动物中有表达。这样的区别也暗示着它们在生物体内可能发挥不同的作用。虽然科学家根据对猪[30]不同组织中Spef2 基因表达研究结果预测人体内也可能存在两种Spef2转录模式，但是目前通过实验只检测到1 种Spef2 转录本[31]。

CH 结构域最早是在钙调蛋白中被发现的，它位于钙调蛋白的N 端，长度大约为100 个氨基酸残基，通常情况下除了肌动蛋白，还有细胞骨架蛋白以及信号蛋白这3 个主要的蛋白类别中也存在着不同数量的CH 结构域[32]。在三维结构上，具有球状褶皱结构的CH 结构域由4 个主要的螺旋结构组成，其中3 个形成了1 个宽松的三重螺旋束结构，彼此之间由loop 结构串联[33]。针对氨基酸序列的分析发现，Spef1 与Spef2的N 端均存在1 个2 型CH 同源结构域(CH2)，这意味着它可能具有结合F 肌动蛋白的能力。而在靠近C 端的位置存在1 个具有钙结合能力的EF-hand 结构，预测可能参与调节Spef2 生物活性。此外，在靠近N 端位置还存在1 个DUF1042 结构域，该结构域的功能目前未知，但是研究发现在与精子鞭毛相关的蛋白[34]中均存在这样的结构域，例如Spata4 蛋白(NP_653245)以及来自单细胞生物莱茵衣藻的Cpc1(AAT40991)。值得注意的是，在Cpc1 蛋白[35]中同样存在EF-hand 结构，科学家通过突变Cpc1 基因的研究发现，它与中央微管的组装有关并能影响鞭毛摆动频率。

2.2 组织表达特异性及生物学功能

Cdc25C[28]是一种细胞周期调节蛋白，该蛋白主要在精巢中表达并参与精巢的某些功能；Cenpb[27]也被认为跟精巢的某些生理功能有关。而Spef1 作为Cenpb 临近的下游基因，很可能也在精巢的某些功能中扮演着重要角色。研究人员通过Western blot 以及RT-PCR 对小鼠不同发育阶段各组织中Spef1 基因mRNA含量的分析发现，Spef1 基因主要在精巢组织中有大量的表达[29]。并利用Spef1 抗体通过免疫荧光的方法对Spef1 在小鼠体内的表达进行定位，结果显示Spef1 在小鼠精巢的生精上皮组织中有大量表达，进一步的实验发现Spef1 在不同时期的曲精小管腔内也会产生离散信号，但是，最早检测到Spef1 信号是在小鼠精子产生的第九个阶段[36]，且随着精子逐渐发育成熟，蛋白信号不断增强，推测老鼠Spef1 可能参与了精子的发生、形成以及鞭毛结构的形成过程。虽然利用免疫技术在精子鞭毛结构的外层致密纤维以及纤维鞘中均发现了Spef1 蛋白的存在，但是它与这些结构之间存在的联系目前尚不清楚。Spef1 蛋白在自然界中分布比较广泛，截至目前，Spef1的一些同源基因已经在脊索动物海鞘Pyrosomella verticilliata[37]以及单细胞原生动物衣藻Chlamydomonas[38]的体内被相继发现。在某些原生动物例如鞭毛虫或者纤毛虫[39-41]中也发现了Spef1 同源蛋白的踪迹，而且在氨基酸序列上高度保守，这些证据表明，Spef1 极有可能参与了鞭毛结构的形成或组装，这种作用可能与它在精子鞭毛的形成过程中所起的作用是相似的。此外，在哺乳动物老鼠、人体内也发现了它的同源蛋白。对Spef1 基因的组织表达特异性分析发现除了精巢，在其它组织中也检测到了微量的Spef1 基因表达，这可能是由于Spef1 在某些具有鞭毛或者纤毛结构的组织中也起着类似作用的缘故[42]。

SIRONEN，et al[34]的原位杂交结果显示Spef2的mRNA 主要在晚期精母细胞以及圆形精子形成阶段表达，而RT-PCR 结果表明，Spef2 基因主要在精子发生的1-7 阶段大量表达，并从第九阶段开始表达信号逐渐减弱，之后利用酵母双杂交系统以及免疫共沉淀的方法验证了Spef2 与蛋白ITF20[43]之间的相互作用关系。基因突变实验结果表明，Spef2 基因突变会导致家猪出现短尾精子从而造成精子运动活力的大幅度减弱[30]，进而影响受精过程。而这些异常的精子会呈现出鞭毛结构中央微管结构、外围纤维鞘结构、外部致密纤维结构以及线粒体鞘结构的异常，最严重的会导致精子鞭毛主体结构的部分缺失[44]，这些结构上的缺陷极大的影响了精子的活力以及受精的成功率。然而，除了在精子细胞，Spef2 也被认为可能在那些含有鞭毛、纤毛以及轴丝结构的组织中有大量的表达，这可能是因为鞭毛和轴丝结构在生物体内有着相同的发育起点。

3 展望

截止目前，除了Sp17 以及Spef1、Spef2 以外还有多种基因被认为参与了精子形成或者受精过程，包括H1fnt、Gopc、Agfg1、Gba2、Crem、MNS1、Spag16、Kif3a 和KLC3 等。然而针对相关基因和蛋白的研究主要局限于哺乳动物，伴随着科学技术的发展与进步，它们在生物体内的功能以及作用机理将被进一步揭示，与此相关的研究也将继续进行，将极大的丰富对于动物生殖发育的研究内容，并可能为医学诊断以及药品开发提供良好的思路和借鉴。