于 骏，武云浩，何 辉，李志然，付杨博，陈 霞，2

（1南通大学医学院，江苏 226001；2南通大学第二附属医院妇产科）

在真核生物中RNA剪接体可以去除绝大多数前体mRNA内含子,并调控mRNA加工过程[1-2]。RNA剪接体参与多种疾病的发生,对细胞存活发挥至关重要的作用[3-5]。精子发生过程在果蝇和人类中高度保守[6-8],可以利用果蝇模型研究男性不育症。本实验拟采用UAS-Gal4系统构建人—果蝇模型,在果蝇S2细胞中实现人SNRPN(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N)基因过表达,观察人SNRPN基因对果蝇S2细胞RNA剪接体的影响,为构建人-果蝇相结合的研究模型奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1 pUAS-HA-hSNRPN质粒构建利用Vector NTI软件设计引物,引物序列:F:5’-ATAAGAAT GCGGCCGCTATGACTGTTGGCAAGAGTAGCA-3’,R:5’-CTAGTCTAGACTAAGGTCTTGGTGGACGCAT-3’。PCR扩增hSNRPN片段,产物进行琼脂糖电泳,割胶回收电泳产物,采用胶回收试剂盒(AP-GX-50,美国Axygen公司)纯化PCR产物。用NotI和XbaI对纯化产物和pUAS-attB-HA空载质粒进行双酶切,并以T4连接酶连接,利用感受态细胞(DH5)对连接产物进行转化,涂布于含有氨苄(Ampicillin)抗性的LB固体培养基上,37℃培养过夜。挑选阳性菌落,采用质粒小量DNA提取试剂盒(AP-MN-P-250,美国Axygen公司)提取质粒,并对提取的质粒进行双酶切验证,并送测序比对。

1.2 S2细胞培养及转染果蝇S2细胞在含10%胎牛血清(04-001-1ACS,以色列Bioind公司)的果蝇Schneider培养基中培养。将S2细胞接种在6孔板上,待细胞生长至密度达到约80%时进行转染。使用Effectene Transfection Reagent进行转染,每孔转染0.8μg质粒,将待转染的质粒与6.4μL Enhancer混合,buffer EC补足至100μL,振荡混匀,静置5 min。然后加入20μL Effectene Transfection Reagent混匀。最后加入600μL Opti-MEM,吹打混匀后加入细胞中,培养48 h后进行后续实验。

1.3 Western blot检测果蝇S2细胞转染48 h后收样,加细胞裂解液PIPA,冰上静置15 min,12 000 g,4℃离心15 min,取上清测定蛋白浓度。……