杨 睿 张光恋

多发性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一种慢性中枢神经系统疾病，由脱髓鞘、炎症和退行性过程导致的不可逆功能障碍[1]。退化过程主要体现于MS患者继发的局部或弥漫性炎症，寻找持续的炎症标志物对于治疗干预非常重要[2]。临床上通常采用中枢神经系统核磁共振成像(MRI)确诊MS复发或炎症反应，然而，复发患者检测炎症反应过程的敏感性极低[3,4]。此外，MRI涉及的成本、检查时间、患者舒适度及钆累积的潜在有害影响导致其无法成为有效的一种检测方法[5]。因此，寻找持续性炎症的血液生物标志物，对于患者日常监测非常重要。

MS发病与中枢神经系统和免疫系统之间的交流障碍有关，而炎性细胞因子会诱导此障碍的发生。肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(TWEAK)是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子配体家族成员的细胞因子，其广泛表达于大脑组织[6]。TWEAK主要由单核细胞、巨噬细胞及神经小胶质细胞分泌[7]，是一种分泌型蛋白，可作为可溶性细胞因子发挥作用。早期已在MS动物模型中证实，TWEAK在中枢神经系统炎症反应期间有促炎作用；然而，在免疫细胞招募通过血脑屏障过程中阻断TWEAK信号可起神经保护作用[8]。MS患者尸检发现，大脑硬化部位TWEAK表达上调，而且还与炎症程度和脱髓鞘密切相关[6]，提示其可能与MS疾病的严重程度相关。神经丝是一种中间纤维蛋白质，在轴突发育、轴突径向生长、成熟神经元轴突皮质细胞结构和运输功能等方面发挥不可或缺的作用。轴突损伤将神经丝释放到细胞外液，在脑脊液中可以测量神经丝轻链(NfF) ，可作为轴突变性的生物标志物[9]。本研究探讨MS患者脑脊液和血清中TWEAK和NfL水平的变化及与病情严重程度的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象和分组

本项前瞻性研究于2017-01—2020-06共纳入本院神经内科就诊的76例MS患者和23例非炎症性神经系统疾病(OND)患者，患者诊断均符合2017修订版McDonald标准[10]。将感觉减退、分离性障碍或紧张性头痛患者(脑脊液和MRI表征正常)纳入OND组(中位数年龄为43岁) 。MS患者包含39例复发缓解型(RRMS组)[包含22例复发期复发缓解型MS(中位数年龄为47岁，病史中位数为59个月)和17例急性加重期复发缓解型MS(中位数年龄为49岁，病史中位数为7个月)]和37例慢性进展型(PMS组)[包含13例继发进展型MS(中位数年龄为51岁，病史中位数为287个月)和24例原发进展型MS(中位数年龄为52岁，病史中位数为61个月)]，急性加重期定义为持续24h以上的局灶性神经系统紊乱[11]。样本采集前RRMS患者4例处在复发缓解期，并接受疾病修饰治疗，其中2例接受干扰素-β、1例接受那他珠单抗、1例接受阿仑单抗。PMS组中3例接受疾病修饰治疗(那他珠单抗、干扰素-β和盐酸芬戈莫德)。另外，有62例MS患者进行了腰椎穿刺时的颅磁共振成像(MRI)，并且还有54例患者还进行了颈部和胸部脊髓MRI检查。66.1%(n=41)的MS患者病灶数>9，32.3%(n=20)的MS患者病灶数在2-9之间，仅1.6%(n=1)的患者头颅MRI成像病灶数<2。

1.2 脑脊液和血清标本采集

患者脑脊液和血清标本在入院后第二天凌晨采集，RRMS患者脑脊液和血清标本在应用甲基去氢氧化可的松治疗前进行收集，按照标准化方案储存，以降低标本中的生物反应[12]，并排除溶血脑脊液标本。采集样本于-80 ℃保存，待所有标本收齐后集中检测。

1.3 脑脊液、血清TWEAK和NfL水平检测

将冻存于-80℃的脑脊液和血清标本于室温解冻，采用酶联免疫吸附试验测定TWEAK和NfL水平，试剂盒为Diaclone SAS产品。具体操作步骤如下：将ELISA试剂盒置于室温环境平衡30min，每孔加入100μl待测脑脊液或血清标本，置于37℃孵育1h；弃去血清，洗板1次，加入新鲜稀释的生物素标记抗体100μl，37℃孵育1h；洗板3次，拍干，再加入100μl酶结合物稀释液，37℃孵育30min；洗板3次，拍干，每孔加100μl显色底物，37℃避光孵育15min；最后加入100μl终止液，3min内完成测定，并记录结果。脑脊液/血清中白蛋白比值作为血-脑脊液屏障功能指标[13]，血清白蛋白采用溴甲酚绿法测定(采用德国西门子全自动生化分析仪及配套试剂)。

1.4 核磁共振扫描(MRI)成像分析

患者入院确诊后采用1.5 Tesla核磁共振扫描仪(Symphony，德国西门子)进行大脑和脊髓核磁共振扫描，分析MS患者病灶数和病变位置。

1.5 MS严重程度评估

应用MS残疾评分(EDSS)、MS严重程度评分(MSSS)和年龄相关的MS严重程度评分(ARMSS)评估患者疾病严重程度[14]。每种评分方式均按照量表内容由专业医师评价完成。

1.6 统计学处理

采用19.0 SPSS统计学软件(IBM公司，Armonk，NY，美国)进行数据统计分析，数据采用中位数、四分位数[M(P25,P75)]表示。Shapiro-Wilk检验用于数据分布分析，Mann-Whitney U-检验用于偏态分布参数中位数比较，一般线性模型用于分析TWEAK和年龄之间强相关性带来的可能混杂偏移，相关性分析采用Spearman's rho检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组患者TWEAK、NfL及疾病严重程度评分比较

RRMS组与PMS组各疾病严重程度评分差异有统计学意义(P<0.05)。与RRMS组比较，PMS组EDSS、MSSS、ARMSS评分均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。各组脑脊液/血清白蛋白比值、血清和脑脊液中TWEAK及NfL水平差异有统计学意义(P<0.05)。除RRMS组与PMS组脑脊液/血清白蛋白比值、脑脊液中NfL水平以及OND组与RRMS组脑脊液TWEAK水平差异无统计学意义(P>0.05)，其余各指标水平两两组间差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组患者疾病严重程度评分及脑脊液和血清生物标志物水平比较[M(P25,P75)]

2.2 脑脊液和血清中TWEAK与NfL水平的相关性分析

MS患者以及RRMS和PMS患者中，脑脊液以及血清中TWEAK与NfL水平均呈正相关(P<0.05)，见表2。

表2 MS、PMS和RRMS患者脑脊液和血清中TWEAK与NfL水平相关性分析

2.3 脑脊液和血清中TWEAK和NfL水平与疾病严重程度评分的相关性分析

MS患者脑脊液TWEAK水平与EDSS评分呈正相关(P<0.01)，血清TWEAK水平与EDSS、MSSS、ARMSS评分均呈正相关(P<0.01)，血清NfL水平与EDSS评分呈正相关(P<0.01)，其余指标间无明显相关性(P>0.05)。RRMS患者血清TWEAK水平与EDSS评分呈正相关(P<0.01)，其余指标间无明显相关性(P>0.05)。PMS患者血清TWEAK水平与EDSS、ARMSS评分均呈正相关(P<0.01)，血清NfL水平与EDSS评分呈正相关(P<0.05)，其余指标间无明显相关性(P>0.05)。见表3、表4、表5。

表3 PMS组患者脑脊液或血清TWEAK水平与疾病评分的相关性分析

表4 RRMS组患者脑脊液或血清TWEAK水平与疾病评分的相关性分析

表5 PMS组患者脑脊液或血清TWEAK水平与疾病评分的相关性分析

2.4 MS患者TWEAK和NfL与MRI成像结果的相关性分析

MRI成像病灶数>9的患者脑脊液和血清中TWEAK水平均显著高于2-9个病灶的患者(P<0.01)；MRI成像病灶数>9的患者血清中NfL水平均显著高于2-9个病灶的患者(P<0.01)。脑脊液和血清TWEAK水平不受病灶位置的影响。见表6。

表6 MS患者MRI成像病灶数和病灶位置对TWEAK水平的影响[M(P25,P75)]

3 讨 论

与公认的神经轴突损伤标志物NfL相比，关于炎性因子TWEAK与MS疾病严重程度的相关性研究较少。有越来越多的证据表明，MS患者病变部位存在炎症反应[15]，实验使用ELISA检测到MS患者脑脊液和血清中TWEAK水平升高。该研究发现MS或OND患者脑脊液与血清中TWEAK水平存在较强的相关性，与早期描述的脑脊液和血清中NfL水平存在相关性一致[16,17]。

本研究发现PMS患者脑脊液或血清中TWEAK水平相比于OND患者升高， PMS患者脑脊液或血清中TWEAK与NfL水平呈显著相关性，慢性活动性或非活动性损伤主要发生在大量炎性小胶质细胞堆积的PMS患者脑组织，而且该炎症性免疫细胞可抑制髓鞘和轴突再生[18,19]。另外，RRMS患者脑主要活动区域的炎症性小胶质细胞具有双重作用，它们可通过分泌促炎细胞因子、细胞毒性因子和招募各种亚型免疫细胞来增强炎症活性。同时，它们又可以终止免疫反应，支持辅助性T细胞的分化，促进髓鞘再生[20]。RRMS患者血清TWEAK与EDSS评分相关可用于解释炎症性小胶质细胞的双重作用。

除了小胶质细胞的不同炎症活化程度外，MS患者硬化病灶在不同神经轴突触死亡的程度上也有所差异；其中活动性病变较慢性活动性或非活动性病变表现出更多的轴突损伤[21]。TWEAK与临床严重程度评分的相关性在血清中最为显著。其原因可能是TWEAK表达主要发生在小胶质细胞轴突上，该细胞还参与血脑屏障的形成，可与血管直接接触[22]。考虑到MS患者硬化病灶周围分布着血管，TWEAK可能部分直接分泌进血液，而非脑脊液。

该项目仍然需要进一步的前瞻性研究，获得更多样本量、随访样本、更详细的MRI报告及上述生物标志物在急性加重期之后的时间变化，以期解释除炎症性病变负荷外，其它如白质或灰质萎缩对MS的影响。总之，本研究发现MS患者血清TWEAK水平升高；TWEAK和NfL水平与疾病严重程度相关，表明小胶质细胞可能在MS神经轴突死亡中起作用；且TWEAK可能是一个可用于评估疾病严重程度的标志物。

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