李姗姗 裴阳 张威 孙立影 姜淼 尚国印 牛思佳 马志斌

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，在全球癌症发病率及死亡率中均高居第三位［1⁃2］。在我国，结直肠癌在近年来也成为发病率增长最快的恶性肿瘤之一，死亡率亦逐年递增［3］。早期预测和发现对改善结直肠癌患者预后至关重要，因此学者们不断试图从结直肠癌的发病机制中寻找靶点，以在始动环节中断其发生。miRNA属于单链式的非编码RNA，长度为18～25个核苷酸，其在肿瘤发生发展和分子靶向治疗中的研究备受关注［4⁃5］。在结直肠癌中，目前也已经发现了几十种异常表达的相关miRNA，miRNA可以作用于细胞成瘤性，从而促进或抑制癌细胞转移和增殖［6⁃7］。本研究在前期的甲基化芯片检测中发现miR⁃429在甲基化前后数值差异显著，提示miR⁃429可能是一种抑癌基因［8］。本研究进一步通过Targetscan软件筛选出miR⁃429与细胞增殖密切相关的靶向基因SIAH1，构建含SIAH1基因3′⁃UTR重组双荧光素酶报告质粒，探讨miR⁃429是否通过靶向调控SIAH1表达而影响结直肠癌细胞LOVO增殖。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人正常结肠黏膜上皮细胞NCM460和结直肠癌细胞系SW480、LOVO、HT⁃29购自ATCC细胞库；miR⁃429 mimic及阴性对照（NC）由上海吉玛制药技术有限公司合成；LipofectamineTM2000试剂盒、TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒以及qRT⁃PCR试剂盒、BCA试剂盒、紫外分光光度计均购自美国Thermo Fisher公司；双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；双荧光素酶报告基因实验转染质粒购自南京博恩生物技术有限公司；倒置显微镜购自麦克奥迪实业集团有限公司；F12K培养基、胰酶、EDTA购自美国Sigma公司；……