王家新，苏 宏，王卫兵，许永忠，郭晨宇，顾小朵，王洪斌

( 1.江苏海洋大学 海洋生命与水产学院，江苏 连云港 222005； 2.江苏省徐州市水族展览馆，江苏 徐州 221006； 3.江苏省宿迁市大江饲料有限公司，江苏 宿迁 223900 )

已有研究表明，海水小球藻(Chlorellapacifica)中的生物活性成分包括多酚类、多肽、多糖等。海藻多糖具有极高的营养价值，并且能提高机体免疫力，联合国粮食及农业组织已将其列入21世纪健康食品名单[1-4]。海藻多糖除了传统的应用价值以外，还具有多种生物活性及医用价值，如抗病毒、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、抗菌抗炎、金属离子络合作用、增强生物体的免疫活性等；有研究表明，海藻多糖可以通过对机体的免疫系统进行调节，从而发挥这些作用[5-6]。海水小球藻取材方便，易培养，因此海水小球藻的研究开发近年来备受关注。

日本蟳(Charybdisjaponica)属节肢动物门、甲壳纲，广泛分布于我国各个海域。日本蟳生长快、移动性小、成活率高，具有较高的经济价值，是重要的海产养殖蟹类[7]。日本蟳肉质中含量最高的氨基酸为谷氨酸，另外天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸含量也比较高，而半胱氨酸和甲硫氨酸含量较少；其中有9种氨基酸是必需氨基酸，占总氨基酸的37%[8]。水生甲壳类动物的血清中免疫活性酶活性是评价机体免疫系统状态的一项重要指标，研究发现，血清中的溶菌酶活性升高，其免疫力也会提高[9]。溶菌酶能够溶解革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，而在水产养殖中引起严重疾病的病原菌大多属于革兰氏阴性菌，因此溶菌酶可用于水产养殖生物病害防治，同时能够减少化学药品对水环境的污染[9]。笔者自海水小球藻中提取粗多糖，研究其对日本蟳部分免疫活性酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和溶菌酶)活性的影响，旨在开发海洋微藻潜在应用价值及探索其在水生动物免疫机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

海水小球藻由江苏海洋大学海洋生命与水产学院藻类生物学实验室提供；试验用海水采自连云港海域[盐度(28.00±1)]，过滤后于121 ℃灭菌20 min，备用；健康日本蟳于2019年5月取自连云港市水产品批发市场，个体规格均匀(约150 g)，活力强，暂养于0.6 m×0.4 m×0.3 m玻璃水族箱中，室温 24 h通气；试验用超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和溶菌酶活性检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；其他化学试剂均为分析纯；海水小球藻培养液采用f/2培养液。

主要仪器：智能光照培养箱(ZGX-300C)、紫外可见分光光度计(T6新世纪)、全波长酶标仪(Synergy HT)。

1.2 试验方法

1.2.1 海水小球藻的培养及多糖提取

无菌条件下，将活化的海水小球藻按1∶10接种至盛有3000 mL灭菌f/2海水营养盐溶液的灭菌锥形瓶中，光照培养[光照度3000 lx，光暗比12 h∶12 h，温度(23±1) ℃]。每日定时摇瓶3次，摇瓶时可随机调整锥形瓶的放置位置，以减少误差[10]。

1.2.2 海水小球藻生长量的测定

每一批次的海水小球藻中，随机选择一瓶作为监测样品，从接种之日开始，每隔24 h，混匀样液后从样品中取3 mL藻液移入比色皿中，以该批次的灭菌海水营养盐溶液作为空白对照，测定其在680 nm的光密度(D680)。

1.2.3 海水小球藻粗制多糖提取

热水浸提法并经乙醇沉淀得到多糖，将醇沉完的溶液8000 r/min(离心半径8.0 cm)离心20 min，弃上清液，沉淀连同移液管一起放入干燥箱中烘干6 h。采用蒽酮比色法测定多糖含量[11-13]。

1.2.4 日本蟳血清取样[14]

选择健康、规格均匀的日本蟳，设试验组和对照组(每组6只，雌雄各半)。试验组每只日本蟳用无菌微量注射器从第三步足基部向腹腔注入200 μL海水小球藻多糖溶液，生理盐水对照组6只按同样方法注射等量生理盐水，无注射对照组6只则不注射任何物质。每组设置3个平行。

注射后的日本蟳在5、24、48、72、96 h(3组每时间点每平行随机取1只日本蟳)分别用无菌蓝芯注射器自第三步足基部采血300 μL,置于1.5 mL无菌Eppendorf离心管中(加EDTA抗凝剂500 μL),混匀，4 ℃冰箱保存24 h，将血浆于4 ℃、8000 r/min(离心半径8.0 cm)离心10 min，去沉淀，上层血清保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.2.5 日本蟳血清中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、溶菌酶活性测定

黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定超氧化物歧化酶活性；磷酸铵法测定过氧化氢酶活性；比浊法测定溶菌酶活性。具体操作方法根据试剂盒说明书进行。

1.2.6 数据分析

采用Microsoft Excel软件进行成组t检验分析，所有试验数据采用平均值±标准差表示，设差异显著性水平为0.05，各组间差异显著(P>0.05)用不同字母表示。

2 结果与分析

2.1 海水小球藻的生长状况及粗多糖提取

取5 mL保藏藻液接种至150 mL灭菌海水f/2营养盐中，每隔24 h取3 mL混匀藻液测D680，得到海水小球藻生长曲线(图1)。海水小球藻藻体量自第2天起呈快速上升趋势，活性很强。蒽酮法测定提取的粗多糖含量，多糖含量为58.99%。

图1 海水小球藻生长曲线Fig.1 Growth curve of green alga C. pacifica

2.2 粗多糖对日本蟳血清中免疫活性酶的影响

2.2.1 粗多糖对超氧化物歧化酶活性的影响

试验组注射海水小球藻多糖后的日本蟳血清中，超氧化物歧化酶在24 h时出现上升趋势，注射后48 h即高于生理盐水组21.8%和未注射组23.1%，与2个对照组相比均差异显著(P<0.05)，而生理盐水组与未注射组差异不显著(P>0.05)；72 h达最高点，比生理盐水组高43.3%，比未注射组高45.2%，与2个对照组相比，差异性均极显著(P<0.01)，同样，生理盐水组与未注射组差异不显著(P>0.05)；72 h后超氧化物歧化酶活性迅速下降，到96 h恢复至对照组水平，72 h后3组无显著差异(图2)。24 h生理盐水组与未注射组相比超氧化物歧化酶的活性有小幅升高，其他无变化。

图2 海水小球藻多糖对日本蟳超氧化物歧化酶活性的影响Fig.2 Influence of green alga C. pacifica polysaccharides on the SOD activity in Japanese stone crab C. japonica

2.2.2 粗多糖对过氧化氢酶活性的影响

试验组注射海水小球藻多糖后的日本蟳血清中，过氧化氢酶在5 h时出现上升趋势，24 h即有明显升高，分别高于生理盐水组和未注射组76.6%、77.4%，与2个对照组相比均差异极显著(P<0.01)，而生理盐水组与未注射组无显著性差异(P>0.05)；48 h达到最高，比注射生理盐水的对照组高79.3%，比未注射的对照组高80.8%，与2个对照组相比，均差异极显著(P<0.01)，而生理盐水组与未注射组无显著性差异(P>0.05)；48 h后过氧化氢酶活性开始下降，72 h仍明显高于2个对照组，具有极显著性差异(P<0.01)，96 h恢复至对照组水平(图3)。24、48 h和72 h的结果显示，试验组与2个对照组相比差异极显著，注射多糖的日本蟳过氧化氢酶活性有显著增强，具有强烈应答。

图3 海水小球藻多糖对日本蟳过氧化氢酶活性的影响Fig.3 Influence of green alga C. pacifica polysaccharides on the CAT activity in Japanese stone crab C. japonica

2.2.3 粗多糖对溶菌酶活性的影响

试验组注射海水小球藻多糖后的日本蟳血清中，溶菌酶活性自5 h出现明显升高，但与对照组差异不显著(P>0.05)；24 h比生理盐水组及未注射组分别高28.8%、29.1%，与生理盐水组相比差异不显著(P>0.05)，但与未注射组相比具显著性差异(P<0.05)，生理盐水组比未注射组略有升高，但无显著性差异(P>0.05)；直至48 h达到最高，比生理盐水组及未注射组分别高42.1%、46.1%，与2个对照组相比均差异极显著(P<0.01)；48 h后溶菌酶活性开始下降，但仍明显高于2个对照组，96 h恢复至对照组水平(图4)。48 h的结果显示，试验组与2个对照组相比差异极显著，注射多糖的日本蟳溶菌酶活性有明显增强，表明海水小球藻多糖能够激活日本蟳的免疫系统，使之产生强烈生理应答。

图4 海水小球藻多糖对日本蟳溶菌酶活性的影响Fig.4 Influence of green alga C. pacifica polysaccharides on the LZM activity in Japanese stone crab C. japonica

3 讨 论

3.1 日本蟳的非特异性免疫

研究证实，多糖对甲壳动物具有免疫调节作用，甲壳动物循环血细胞具有吞噬和包囊入侵异物的作用。如凝集素和酚氧化物酶原激活系统能对入侵的细菌、真菌表面脂多糖或真菌细胞壁成分1,3-β-D-葡聚糖进行识别结合，促进吞噬细胞的吞噬[15-16]。杨福刚等[17]报道，凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)免疫系统中存在着识别β-葡聚糖的结合蛋白，当两者相结合时，结合物可与颗粒细胞膜的受体相结合，从而激活免疫系统。甲壳动物属于无脊椎动物中的一个大类，并且其中很多都是具有较高经济价值的养殖种类，随着养殖规模的不断扩大，养殖甲壳动物的病虫害防治成为一项艰巨而重要的任务。传统的水生养殖动物病害防治主要依靠抗生素及化学药物，不但污染水源，而且长时间使用抗生素及化学药物还会使水产养殖生物的体内蓄积大量有害物质，通过食物链进入人体从而威胁人类健康[18]。因此，对甲壳动物免疫力的研究，提高水产养殖动物自身的免疫活性就成为一个重要的研究方向。

3.2 海水小球藻多糖对日本蟳抗氧化酶活性的增强效果

超氧化物歧化酶的活性与生物的免疫水平密切相关，对于增强吞噬细胞的防御能力和整个机体的免疫功能有重大作用。当酶活性较低时，生物体内活性氧量过多，势必会扰乱、破坏一些体内重要的生物分子，导致代谢紊乱，生理功能失调，体内免疫水平下降，潜在的病原被激活，使机体发病[19]。刘恒等[20]报道，用添加免疫多糖的饲料投喂凡纳滨对虾后，凡纳滨对虾肌肉中免疫酶的活性有一定的提高，表明口服多糖可以提高凡纳滨对虾的免疫力，而免疫水平的提高又会增强对虾肌肉等部位的活力。过氧化氢酶主要生理作用就是将体内代谢物H2O2催化分解为H2O和O2。刘树青等[21]发现，对中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)注射免疫多糖后，血清中的过氧化氢酶活性比对照组明显增高，表明通过提高动物血液中抗氧化酶活性，可以减少自由基对正常细胞的损伤，清除细胞生理代谢过程中产生的活性氧，从而提高机体的解毒免疫功能和防病抗病能力，因此认为抗氧化酶的活性也可作为一项免疫指标来衡量对虾机体免疫机能。本试验设置了两组对照试验，一组是注射等量生理盐水的日本蟳，一组是未注射的日本蟳。试验结果显示，在注射海水小球藻粗多糖后，日本蟳的抗氧化酶的活性均有不同程度的提高，并且与对照组差异显著。注射生理盐水的日本蟳血清中抗氧化酶比较稳定，在24 h后与未注射的对照组相比略有升高，其他时间无变化。说明海水小球藻多糖对日本蟳具有较强烈诱导免疫应答作用。其中过氧化氢酶活性72 h后有明显降低，但与对照组相比，其活性仍保持在一个较高水平上，并具有显著性差异，与贾超艳[22]的试验结果有一定的差异，经分析认为，这可能与日本蟳的产地和养殖环境有关，并且二者给日本蟳注射多糖的种类和剂量也有所不同，使得日本蟳的免疫反应有差异。

3.3 海水小球藻多糖对日本蟳溶菌酶活性的增强效果

溶菌酶在多种动物的血液和血细胞中均广泛存在，是非特异性免疫因子的主要成分，在免疫活动中发挥着重要作用。溶菌酶主要杀灭的是革兰氏阳性菌，能够水解细菌细胞壁β-1,4糖苷键，从而使细菌的细胞壁破损，细胞崩解，而且溶菌酶还是吞噬细胞杀菌的物质基础[23]。王雷等[24]研究发现，正常中国明对虾的血淋巴中溶菌酶活性较高，而在濒死中国明对虾血淋巴中未检测到溶菌酶，说明溶菌酶活性也可以作为检测对虾机体免疫功能状态的指标之一。刘树青等[25]报道，日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)经注射1%海藻多糖和1%北虫草多糖后，血淋巴中的溶菌酶活性大大增加。本试验结果表明，注射海水小球藻多糖后，日本蟳血清溶菌酶活性的变化最为明显，升高较快，注射后5 h就出现明显的升高，但与对照组差异不显著；24 h接近最高值，并且能在较长时间里保持一个较高的水平，与生理盐水组相比差异不显著，但与未注射组差异显著；注射后48 h溶菌酶活性达到最高，分别高于生理盐水组和未注射组42.1%和46.1%。

4 结 论

给日本蟳进行人工注射海水小球藻粗多糖能够刺激其免疫系统产生应答，一定时间内能提高其免疫酶活性，增强其免疫力。若在实际养殖生产中，将海水小球藻粗多糖添加于甲壳动物养殖饲料中，结合动物口服途径，将对病害防治和水产动物健康养殖以及发展绿色水产品等都具有深远的意义。本试验提取粗多糖，经测定其中多糖含量为58.99%。本试验未涉及粗多糖中其他成分和养殖海水中其他环境因子对酶活性的影响。