陈书秀，李 霞，赵 楠，孙 娟，史 良，李晓捷

( 山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东 烟台 264003 )

笼目海带(Kjellmaniellacrassifolia)，又称厚叶切氏海带、厚叶解曼藻，属褐藻门、褐藻纲、海带目、海带科，主要分布于日本北海道函馆和室兰的深水区[1]。笼目海带含有较丰富的岩藻多糖硫酸酯，且其他杂糖含量相对较少，因此是制备提取岩藻多糖的良好优质原料。岩藻多糖硫酸酯具有调节血脂、降血糖、降血压、抗肿瘤等功效[2]。

笼目海带是一种大型褐藻，一般在冬季和初春生长和繁殖，研究温度、光照对其生长、发育的影响，对苗种繁育及养殖均有重要意义。已有很多温度、光照、营养盐与海带(Laminariajaponica)生长发育的相关报道[3-9]，但针对笼目海带的研究还较少。目前，海带种苗生产主要采用孢子体采苗，兼有配子体克隆育苗[10]，与孢子体采苗相比，配子体克隆育苗可使品种纯度高且育苗时间不受季节限制。虽然配子体克隆育苗技术在海带试验中应用较广，但在规模化生产上应用较少[11]，这主要是因为海带雌、雄配子体的发育不同步以及孢子放散量的限制，从而限制其在实际规模化育苗中的应用。

笔者以笼目海带雌、雄配子体为材料，通过显微观察配子体生长、发育状况，计算配子体萌发率等，探究不同温度对其配子体生长、发育的影响，为笼目海带克隆育苗技术提供参数，为笼目海带规模化育苗打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及培养条件

笼目海带配子体保存条件为温度10 ℃，盐度31，光照度1000 lx，光周期24L∶0D。在直径12 cm的培养皿中进行培养，取适量的雌、雄配子体，分别用300目筛绢过滤，获得2～5个细胞的细胞段悬浊液，按照2∶1的比例，将雌、雄配子体混合，取10 mL悬浊液加入到直径12 cm的培养皿中，置于不同温度下培养，光周期10L∶14D，光照度1000 lx。海水经过滤、消毒、冷却后，添加硝酸钠、磷酸二氢钾、柠檬酸铁作为培养液，培养液中总氮4 mg/L、总磷0.4 mg/L、铁0.05 mg/L。温度设置5、8、12、15、20、25 ℃ 6个处理组，每组3个平行。

1.2 配子体生长、发育指标的测定

在显微镜下观察配子体的生长发育状态，每3 d显微拍照1次，培养周期为30 d。

配子体发育率的计算：每个培养皿随机观察10个100倍视野，分别统计卵囊形成、排卵、幼孢子体和总细胞数，萌发率为卵囊形成数、排卵数和孢子体数之和占总细胞数的百分比。

1.3 数据处理

用SPSS 19.0软件对发育率进行单因子方差分析、多重比较，P<0.05表示差异显著。用Excel软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同温度对笼目海带配子体细胞形态的影响

在20 ℃条件下时，笼目海带配子体仅营养生长，不发育，无卵囊形成，外观形态变化见图1a～c。随培养时间的延长，配子体细胞段分支，颜色深，细胞质分布均匀，细胞段数目增多，配子体的细胞数量显著高于其他各组(图2)；25 ℃条件下，配子体大量死亡，极少数的存活细胞生长极度缓慢且不发育(图2)。

图1 笼目海带雌配子体生长发育过程Fig.1 Growth and development of female gametophytes in seaweed K. crassifoliaa.打碎后的雌配子体； b.雌配子体营养生长初期； c.雌配子体营养生长后期； d.雌配子体卵囊形成； e.雌配子体排卵； f.幼孢子早期形态.a.fragment of female gametophyte; b.early stage of vegetative growth of female gametophyte; c.late vegetative growth stage of female gametophyte; d.oogonium development of female gametophyte; e.ovulation of female gametophyte; f.early morphology of juvenile sporophyte.

在5～15 ℃条件下，15 d后，约有5%～15%的雌配子体发育为成熟的卵囊(图1d)；15～28 d，大部分雌配子体生成成熟卵囊、排卵并受精形成幼苗(图1e、f)。其中5 ℃和15 ℃条件下最终的卵囊形成率、排卵率及小苗形成率显著低于8 ℃和12 ℃处理组(图2a～m)，28 d时，8 ℃和12 ℃条件下配子体发育率为85%～90%，其中约50%为多细胞幼苗(图2f、i)。

2.2 不同温度对笼目海带配子体萌发率的影响

试验结果表明(表1)，第15天，8、15 ℃条件下有卵囊形成，12 ℃条件下出现卵囊形成并排卵，5 ℃条件下出现卵囊及排卵的时间稍晚于以上3组。高温(20、25 ℃)最终均未出现配子体发育。在整个培养周期中，温度对笼目海带配子体萌发率有显著影响(P<0.05)。多重比较结果表明，从第19天开始，温度为8、12 ℃时萌发率显著高于其他各组。第28天，5、15 ℃时最终萌发率为23.85%、34.41%，8、12 ℃时最终萌发率高达88.47%、88.59%(图3)。

表1 笼目海带雌配子体在不同温度下萌发情况观察 %

图3 不同温度下笼目海带配子体萌发率Fig.3 The germination rate of gametophytes in seaweed K. crassifolia exposed to different temperatures小写字母下标相同数字的为同一组多重比较，同一组的不同字母表示差异显著(P<0.05).The letters on the histogram with the same number are compared as the same group; the different letters in the same group represent significant differences (P<0.05).

笼目海带配子体发育的最适温度为8～12 ℃，低温5 ℃和高温15 ℃均对其配子体的发育有抑制作用，高于20 ℃时配子体不能正常发育。

3 讨 论

3.1 温度对笼目海带配子体生长的影响

方宗熙等[12]发现，人工培养条件下海带雌、雄配子体均可形成无性繁殖系(又称克隆系)并可单独培养，此后其逐步并广泛应用于基础生物学研究以及海带杂交育种[13-14]。曾呈奎等[15]最早发现，海带配子体适宜生长和适宜发育的温度条件分别是15 ℃和10 ℃；李晓捷等[16]对901海带配子体的研究也得出相似结论，并且发现25 ℃是其致死温度。本试验结果表明，笼目海带配子体在20 ℃时生长速度显著高于其他组，这与孙娟等[17]对多肋藻(Costariacostata)配子体的研究及王军等[18]对利尻海带(L.ochotensis)配子体的研究结论相似。

3.2 温度对笼目海带配子体发育的影响

本试验中观察到，笼目海带配子体在5～15 ℃均可发育，8～12 ℃下，大部分配子体(80%～90%)进入生殖生长状态，且50%以上为多细胞幼苗。在5、15 ℃条件下，大部分配子体(70%～80%)处于营养生长状态，虽有部分配子体(20%～30%)进入生殖生长状态，但明显滞后于8～12 ℃温度组。20 ℃和25 ℃下所有配子体维持在营养生长状态。王军等[18]也发现，温度对利尻海带的配子体成熟度有影响，在10 ℃条件下，雌、雄配子体的成熟度最高；在20 ℃条件下，配子体不发育。Martins等[19]证实，掌状海带(L.digitata)配子体生长的最适温度为10～18 ℃，而发育的最适温度为5～15 ℃。Schreiber[20]发现，糖海带(L.saccharina)配子体生长的最适温度为13～18 ℃，而发育的最适温度为6 ℃。

4 结 论

笔者仅利用单因子试验研究温度对笼目海带配子体生长发育的影响，结果表明，海带配子体发育的最适温度为8～12 ℃，建议大规模育苗前期采用8～12 ℃，以达到短期内获得大量孢子体的目的。但是各种环境因子对海带配子体的生长发育的影响一般存在着交互作用，因此笼目海带配子体发育所需的最佳环境因子如光照度、光照周期及盐度等是下一步研究的重点，以便为笼目海带的大规模养殖提供理论支持。