刘项峰，谢 玺，陈 微,2，朱守维，滕炜鸣，李大成，李晓东，王庆志

( 1.辽宁省海洋水产科学研究院，大连市海产贝类种质资源创新利用重点实验室，辽宁 大连 116023； 2.大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连 116023； 3.锦州市科学技术研究院，辽宁 锦州 121000； 4.沈阳农业大学 畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866 )

四角蛤蜊(Mactraveneriformis)俗称白蚬子、白蚶子，属软体动物门、双壳纲、真瓣鳃目、蛤蜊科、蛤蜊属，营底栖生活，广泛分布于中国、韩国及日本沿海的潮间带中、低潮区及浅海泥沙滩，肉质细嫩、味道鲜美[1]。在辽宁沿海潮间带，四角蛤蜊自然资源分布面积达到1.1×104hm2，占辽宁潮间带贝类资源分布总面积的28.3%，居滩涂贝类之首，资源量约8×104t[2]。辽河口海域滩涂贝类资源丰富，盛产四角蛤蜊、文蛤(Meretrixmeretrix)、光滑河篮蛤(Potamocorbulalaevis)、毛蚶(Scapharcasubcrenata)等双壳贝类。2009—2010年调查发现，辽河口海域四角蛤蜊资源量约3.8万t[3]。近年来，由于各种原因，四角蛤蜊资源量在不同年份常出现较大波动，查明该海域四角蛤蜊的繁殖生物学特性，可为保护与开发辽河口海域的四角蛤蜊资源提供有益参考。

关于海产双壳贝类繁殖周期的研究报道较多，如波纹巴非蛤(Paratapesundulatus)[4]、钝缀锦蛤(Tapesdorsatus)[5]、栉江珧(Atrinapectinata)[6]、青蛤(Cyclinasinensis)[7]、长牡蛎(Crassostreagigas)[8]、菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[9]等种类均有相关报道。关于四角蛤蜊生殖周期的研究，有对山东北部沿海四角蛤蜊性腺发育年周期的研究[10]、韩国群山沿海四角蛤蜊繁殖周期的研究[11]及东京湾四角蛤蜊繁殖周期的研究[12-13]。海产双壳贝类通常不易精确统计其确切的产卵次数，通常只能以一年中的产卵高峰期进行界定，且与其生境息息相关。辽河口海域受地理位置和气候等因素影响，与上述报道生境差异较大，但相关报道较少，仅见项福椿[14]对四角蛤蜊性腺的外观观察，对辽宁沿海四角蛤蜊的性腺发育进行粗略的分期。笔者对辽河口海域四角蛤蜊的条件指数、性腺发育周期与性比等繁殖生物学特征进行深入研究，以期为四角蛤蜊的人工繁育与资源养护提供参考。

1 材料与方法

1.1 采样地点与方法

试验样品采自辽宁省盘锦市大洼县二界沟镇西南辽河口南部海域。2018年3—10月，每月现场采样一次，同时利用YSI6920水质分析仪测量水温、盐度与叶绿素a。随机收集80～100枚四角蛤蜊样品，低温保存运回实验室进行分析。

1.2 条件指数

每月取30枚四角蛤蜊样品进行解剖，分离软体部与贝壳，105 ℃烘干至恒等质量，分别称取软体部与贝壳干质量(精确至0.01 g)，计算条件指数(软体部干质量占贝壳干质量的百分比[15])。

1.3 组织学分析

每月取30～40枚四角蛤蜊样品进行解剖，在性腺组织上切取边长5 mm方形组织块，放入波恩氏液中固定24 h后转移至70%体积分数乙醇中储存。梯度乙醇脱水、石蜡渗透包埋，进行切片(5～6 μm)，苏木精—伊红染色，中性树脂封片。光学显微镜下镜检，辨别性别与性腺发育程度。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0软件，对条件指数月间差异显著性进行单因素方差分析，对性比进行卡方检验。

2 结 果

2.1 环境因子变化

取样海区的海水温度、盐度及叶绿素a质量浓度月间变化见图1。水温季节性变化明显，在试验周期内，3月水温最低，为2.0 ℃。随着春、夏季的到来及气温的升高，水温持续升高，8月水温达到高峰，为26.40 ℃，秋季水温下降。盐度季节性变化明显，春季为枯水期，盐度较高，3月盐度最高，为31.6；

图1 取样海区水温、盐度及叶绿素a质量浓度月度变化Fig.1 Monthly variations in water temperature, salinity and chlorophyll a concentration in the survey area

夏、秋季随着辽河淡水大量进入，盐度降低，7月最低，为27.0；随着秋、冬季枯水期到来，盐度又逐渐升高。叶绿素a质量浓度有2个高峰期，分别为6月(4.63 μg/L)和10月(4.86 μg/L)。

2.2 样品壳长、壳高与湿质量

全年采集样品平均壳长(34.73±1.89) mm，平均壳高(31.88±1.97) mm，平均湿质量(15.17±3.18) g(表1)。

表1 四角蛤蜊月平均壳长、壳高与湿质量

2.3 繁殖周期

2.3.1 条件指数

条件指数在6月最低，为8.66，3—6月维持相对稳定，7月开始显著增高，到9月达到峰值，为14.43，10月又降至10.30(图2)。

图2 四角蛤蜊各月干壳质量、软体部干质量及条件指数 Fig.2 Monthly values of dry shell weight, dry soft part weight and the condition index of clam M. veneriformis不同字母表示组间差异显著 (P<0.05).Different letters show the significant difference between groups (P<0.05).

2.3.2 性腺发育周期

参考文献[9]对海产双壳贝类性腺发育各期特点的描述，将四角蛤蜊性腺发育过程分为6期(图3、图4)：

休止期：生殖细胞未发育，无法分辨性别。

形成期(2—4月、7月)：两性性腺开始发育；雌性仅在滤泡壁上可见刚刚发育的卵，卵很小 (图3a)；雄性在滤泡壁上出现分层的精原细胞，数量逐渐增加并且逐渐有精母细胞产生，无精细胞或精子(图4a)。

图3 雌性四角蛤蜊性腺发育分期Fig.3 Gonadal developmental stages for female clam M. veneriformisa.形成期；b～c.增殖期；d.成熟期；e.排放期；f.耗尽期.a.early developing; b—c.late developing; d.ripe; e.spawning; f.spent.

增殖期(3—5月、7—8月)：两性性腺加速发育；雌性在滤泡腔中可见成熟卵子，但数量较少，多数卵子依靠短柄附着于滤泡壁上(图3b～c)；雄性滤泡中同时存在精原细胞、精母细胞、精细胞和精子 (图4b～c)。

成熟期(4—6月、8—9月)：两性性腺体积增大，生殖细胞大量成熟；雌性在滤泡腔内充满大量成熟卵子，滤泡壁薄(图3d)；雄性在滤泡腔内充满大量成熟精子 (图4d)。

图4 雄性四角蛤蜊性腺发育分期Fig.4 Gonadal developmental stages for male M. veneriformisa.形成期； b～c.增殖期； d.成熟期； e.排放期； f.耗尽期.a.early developing; b—c.late developing; d.ripe; e.spawning; f.spent.

排放期(5—7月、10月)：两性生殖细胞开始排放；雌性滤泡内游离卵子的数量减少，滤泡壁破裂(图3e)；雄性在滤泡中成熟精子占比巨大，并因精子排放而出现空腔(图4e)。

耗尽期(7—8月、11月)：两性性腺的滤泡破裂、分散，发生吞噬作用；雌性仅有少量卵子残留 (图3f)；雄性残留少量精子(图4f)。

2.3.3 性比

共采集四角蛤蜊样本712个，其中41.43%为雌性，46.49%为雄性，1.41%无法分辨性别，10.67%为雌雄同体。雌雄同体表现为雄性生殖腺混有少量雌性生殖细胞或滤泡的雌性化特征。性比1∶1.12，经卡方检验，与期望值(1∶1)差异不显著(χ2=1.014；df=1；P>0.05)(图5)。

图5 四角蛤蜊性别百分比Fig.5 Proportions of males, females, androgynies and undifferentiated individuals of clam M. veneriformis

3 讨 论

3.1 环境因子与繁殖周期的关系

海洋双壳贝类广泛分布于世界各地，栖息环境也各不相同，因此其应对自身栖息环境所选择的繁殖策略也各不相同。Taylor等[16-18]研究指出，温度和饵料对贝类繁殖影响最大。适宜的温度和充足的食物是四角蛤蜊进行繁殖活动的必要条件[10]。本试验中，在3月水温最低的时候，叶绿素a质量浓度较高，四角蛤蜊开始进行配子发生，随着温度升高，雌、雄配子逐渐发育成熟，此时，水体中叶绿素a质量浓度也在逐渐升高；在5—6月，成熟的精子和卵子大量排放，而水体中叶绿素a质量浓度达到一年中的第一个高峰，水温达21 ℃，此时环境因子有利于胚胎的发育和幼体存活；7月开始，水温继续升高，叶绿素a质量浓度持续下降，四角蛤蜊开始进入快速恢复期，在10月水温降至15～20 ℃，叶绿素a质量浓度上升并达到第二个高峰时，一部分四角蛤蜊第二次排放配子。

3.2 条件指数

条件指数一般在贝类繁殖生物学研究领域用来评定贝类的成熟度。Kang等[8]报道，条件指数与长牡蛎的性腺发育密切相关，随着性腺成熟度不断提高而升高，随着配子排放而降低。本试验中，观察性腺发现，条件指数与四角蛤蜊性腺发育周期密切正相关。条件指数在3月随着性腺成熟而升高；在4—6月的配子排放期中保持不变并在后期降低；在7月耗尽期结束后急速上升，并维持较高水平直至9月；在10月第二次产卵高峰后又下降。

3.3 繁殖周期

海产双壳贝类很难精确测定其产卵次数，一般通过形态学和组织学方法进行观察，确定每年主要的产卵高峰期[19]。本试验中，通过对四角蛤蜊样品条件指数的计算和性腺组织学的观察，并对结果进行分析得知，盘锦辽河口海域四角蛤蜊全年有两个产卵高峰，一个为4—6月，另一个为10月上旬。相较而言，10月上旬产卵(排精)个体少于4—6月。这与项福椿[14]报道的辽宁沿海四角蛤蜊产卵期结果相似，其主要产卵期在5—6月，9月上旬为第二次产卵期；也与Iwata等[12-13]对东京湾四角蛤蜊繁殖周期的研究结果相似，为东京湾四角蛤蜊每年的产卵季分别为4—7月和9—10月上旬。但柯巧珍等[10-11]研究表明，山东北部沿海四角蛤蜊产卵期和韩国群山沿海四角蛤蜊的产卵期每年只有一次，为7—8月，这与本试验结果不同，这可能是由不同海域环境因子差异较大所致。本试验组织学观察结果显示，四角蛤蜊样品的两性性腺发育同步，精子和卵子同时排放，在7月几乎全部排空；8月一部分个体性腺进行第二次发育，10月上旬排出两性配子。两性性腺同时发育，两性配子同时排出是贝类繁殖成功的重要基础[17]。本试验结果表明，四角蛤蜊精子和卵子在第一次产卵高峰(4—6月)大量集中排放，第二次产卵高峰(10月上旬)排放量较少，这可为提高该地区四角蛤蜊人工育苗技术水平提供理论依据。

3.4 性比

从性比上看，本试验采样海域的四角蛤蜊雌、雄数量差异不显著，与项福椿[14](1∶1.08)和Chung等[11](1∶1.046)的研究结果相近，与安立会等[21]的研究结果有一定差异，与柯巧珍等[10](1.138∶1)的研究结果相反。这有可能与不同地理种群差异或抽样误差有关。同时安立会等[21]报道了辽东湾四角蛤蜊出现雌雄同体的性变现象，并认为是由壬基酚和双酚A的污染影响所致，并且性变比例与性腺成熟度呈正相关。本试验也有相同结果，但性变比例较小，这种不同的主要原因应是采样方法和采样时间不同，本试验所采性腺成熟度高的样本比例较安立会等[21]的比例低。

4 结 论

辽河口海域四角蛤蜊有两个产卵高峰，主要是4—6月，其次为10月。条件指数分析结果显示，在7—9月有一个快速恢复期，一部分四角蛤蜊个体的性腺第二次发育，并在10月排出配子。条件指数分析结果和组织学观察结果相符合，可以作为判断性腺成熟度的指标。