魏薇，张继婕，刘中艺，高思

摘  要：采用中药网络药理学方法探讨绞股蓝治疗阿霉素心肌病的药效物质基础和潜在作用机制.通过检索TCMSP、SymMap、TCMID数据库平台获取绞股蓝的候选药效成分，并借助Uniprot数据库获取候选药效成分的潜在作用靶点;采用Cytoscape 3.8.1软件构建有效成分-靶点蛋白相互作用网络图;运用Genecards、OMIM数据库筛选阿霉素心肌病的疾病相关靶点，结合String数据库绘制药物-疾病基因的蛋白互作网络;采用Metascape数据库对交集靶标进行基因功能分析（GO）及KEGG通路富集分析，对绞股蓝改善阿霉素心肌病的作用机制作出合理推测.共筛选出绞股蓝有效活性成分26个，包括槲皮素、谷甾醇、绞股蓝皂苷等，活性成分发挥作用的潜在靶标有89个，主要有TNF-α、TP53、AKT1、IL-6等;靶点参与的功能主要有氧化应激、凋亡调控、炎症因子刺激反应、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性调节等，主要富集通路有p53、TNF-α、PI3K-Akt、AMPK等信号通路，以及线粒体自噬和细胞钙调控通路等.结果表明，绞股蓝中槲皮素、谷甾醇、绞股蓝皂苷等有效活性成分能够通过调节p53、TNF-α、Akt、AMPK等信号分子，参与细胞程序性死亡、氧化应激和线粒体稳态调控，从而达到防治阿霉素心肌病的目的.

关键词：绞股蓝;网络药理学;阿霉素心肌病;药效物质基础;分子机制

中图分类号：R282.710.5;R259.422           DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.04.017

0    引言

阿霉素是一种广谱抗肿瘤抗生素，常用于多种恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、恶性淋巴瘤等的临床治疗，但其在临床应用中具有产生严重心脏毒性的风险.自1973年Lefrak等[1]首次报道阿霉素可引起心肌损伤以来，相关学者深入研究了阿霉素心肌病的发生机制和防治策略.国内外现有研究主要集中在毒性代谢产物、自由基爆发、线粒体损伤、心肌钙超载等方面，目前对阿霉素引起的心脏毒副反应尚无针对性的临床防治药物[2].近年来，国内外学者开始关注传统中药[3]，以期从中寻找到有效防治阿霉素心肌病的药物.已发现，薯蓣皂苷、杨梅苷、丹参酮IIA、黄连素等多种天然产物的活性成分可有效改善阿霉素诱导的心肌细胞死亡和线粒体损伤.

绞股蓝系葫芦科绞股蓝属草质攀援植物，又名“七叶参”，其性寒，味甘，微苦，归肺、脾、心、肾经，有清热解毒、止咳、清肺、化痰等功效，可用于降血压、调血脂及治疗多种恶性肿瘤[4].心血管药理研究表明，绞股蓝皂苷对治疗高胆固醇血癥[5]和心肌缺血再灌注损伤[6]有较好疗效，可有效改善血脂紊乱并对心脏有直接保护作用.此外，绞股蓝皂苷具有抑制脂质过氧化、阻止心室肌细胞Ca2+内流等药理学作用[7]，可通过提高心肌组织ATPase及SDH活性减轻阿霉素造成的心功能紊乱.

现代生物信息学快速发展，使中药网络药理学逐渐成为揭示中药复方分子机制的一种系统且高效的新方法.该方法可通过研究药物、靶标及疾病之间的关系，从分子和整体2个不同角度探究药物对疾病的影响，这与中药多成分、多靶点、多通路的原理相符.本研究基于网络药理学探讨绞股蓝防治阿霉素心肌病的药效物质基础和潜在分子机制，为绞股蓝的心血管实验药理学研究和临床应用提供参考.

1    资料与方法

1.1   绞股蓝候选药效成分的搜集与筛选

以“绞股蓝”或“gynostemma pentaphyllum”为关键词分别检索TCMSP、SymMap、TCMID数据库，查询并整理出绞股蓝所含全部活性成分;设置标准口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%筛选药物有效活性成分，并进一步以类药性指数（drug like index，DL）≥0.18为筛选标准，最终确定绞股蓝候选药效成分.数据库及分析平台网址见表1.

1.2   绞股蓝有效活性成分作用靶点的获取及潜在靶蛋白的筛选

检索TCMSP数据库平台，获取绞股蓝相关作用靶点;查询Uniprot数据库中全部已验证的人类基因及对应的基因名称，并按照数据库标准名称对绞股蓝作用靶点进行靶点基因注释，得到绞股蓝有效活性成分潜在作用靶标.运用Cytoscape3.8.1软件，构建有效活性成分-靶标网络图并进行可视化分析.

1.3   阿霉素心肌病作用靶点的获取及相关靶蛋白的筛选

利用Genecards及OMIM数据库，检索关键词“doxorubicin cardiomyopathy or adriamycin cardiomyopathy”，筛选并导出疾病相关靶标.整理在数据库中搜集的疾病靶标，删除重复靶标并进行标准化处理.

1.4   绞股蓝活性成分与阿霉素心肌病共同靶标的筛选及PPI网络图的构建

通过在线作图网站微生信筛选出绞股蓝活性成分与阿霉素心肌病的共同靶标（即交集基因），制作维恩图，获得绞股蓝抗阿霉素心肌病的潜在作用靶点.应用String 11.0数据库，输入药物-疾病交集基因，物种选择“人类”，设置隐藏游离靶点，将最低互作分数设为0.9，构建蛋白质互作网络（protein-protein interaction networks，PPI）.

1.5   绞股蓝作用于阿霉素心肌病的GO富集分析和KEGG通路富集分析

采用Metascape数据库，限定物种为“Homo Sapiens”（人源），设定P值小于0.01，对药物-疾病基因进行GO功能分析以研究绞股蓝抗阿霉素心肌病的主要生物过程;进行KEGG通路富集分析以研究药物抗疾病的相关信号通路.

2    结果

2.1   绞股蓝候选药效成分及其靶蛋白

通过TCMSP等数据库，搜集到绞股蓝全部活性成分，参考药代动力学ADME参数，共筛选出包括绞股蓝皂苷、谷甾醇、槲皮素、鼠李素等26个有效活性成分（见表2），其中有10个（未自定义编号）并未参与网络图构建，这表明绞股蓝还有一些成分的功效未被挖掘.此外，胆固醇虽是绞股蓝有效成分之一，但其主要来源于人体自身合成和日常饮食，因而不将其纳入活性成分中研究.

绞股蓝有效活性成分对应靶点蛋白共245个，运用Uniprot数据库进行靶点基因注释，共获得177个靶点基因.将靶点基因导入Cytoscape3.8.1软件，构建绞股蓝有效活性成分-靶点相互作用网络图，如图1所示，显示有194个节点和261条边.有效成分-靶点网络图揭示了绞股蓝有效活性成分与潜在靶点之间的相互作用关系，药物的某一有效活性成分会与多个潜在靶点相互作用，不同的有效活性成分也会作用于同一个靶点，反映出中药绞股蓝多成分、多靶点的作用特点.

2.2    绞股蓝活性成分与阿霉素心肌病的交集作用靶标

以关键词“doxorubicin cardiomyopathy or adriamycin cardiomyopathy”分别检索Genecards及OMIM数据库，筛选阿霉素心肌病的作用靶点;以相关性得分为标准，共筛选出586个疾病作用靶点.将所搜集的药物靶点和疾病靶点取交集，并导入在线作图平台微生信，绘制维恩图（图2）.       结果得出药物-疾病交集靶基因共89个，包括  TNF-α（tumor necrosis factor -α）、CASP3（caspase-3）、TP53（cellular tumor antigen p53）、NOS2（nitric oxide synthase， inducible）、MAPK1（mitogen-activated protein kinase 1）、AKT1（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase）等.

注：圆圈为中药绞股蓝有效活性成分作用靶点，灰色方形为疾病

作用靶点，重叠部分为中药绞股蓝作用于疾病的靶点.

2.3    构建PPI网络图并筛选核心网络

采用String数据库，物种选择“人类”，置信度为默认值0.900，绘制PPI网络图，分析药物-疾病交集靶蛋白间的相互作用关系.PPI網络图共包含89个节点，365条边，计算出平均节点度值为8.2，节点的度值表示药物靶点与疾病靶点间的相连边数，度值越大表明该节点在PPI网络图中可能起着关键性作用（见图3）.本研究保留了大于平均节点度值的基因，疾病靶标有TP53、AKT1、CASP3、TNF、MAPK1及IL6（interleukin-6）等.

2.4   关键靶点功能注释和通路富集分析

将药物-疾病交集靶标导入Metascape数据库，进行GO功能分析，筛选得到关键靶点的主要生物过程，涉及氧化应激、细胞存活与死亡、细胞因子刺激反应、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性调节等.显著性最强的前20条通路见图4.

通过KEGG通路富集分析，获得关键靶点的通路共182条，显著性最强的前20条通路见图5.包括p53、TNF-α、PI3K-Akt、AMPK、NF-κB等信号通路，以及细胞钙调控、线粒体自噬和细胞凋亡信号通路等，提示绞股蓝有效活性成分通过多通路以及多靶点发挥心肌保护作用.

3     讨论

3.1    绞股蓝药效物质基础

本研究通过网络药理学分析，共筛选出绞股蓝皂苷、谷甾醇、槲皮素及豆甾醇等26种绞股蓝有效活性成分和作用于阿霉素心肌病的89个有效靶点.通过有效成分-靶点网络分析可知，槲皮素、豆甾醇、谷甾醇等成分的关联靶点相对较多，与阿霉素心肌病联系密切.实验研究已表明，经高速逆流色谱（HSCCC）[8]、D101树脂和硅胶柱色谱法[9]及加热回流法[10]等方法可从绞股蓝中提取出槲皮素、芦丁、绞股蓝皂苷及人参皂苷等活性物质.经提取并纯化的槲皮素具有较强的抗氧化活性[8]，其可通过提高Nrf2的表达来增强机体的抗氧化能力并改善生化及组织学异常，进而减轻阿霉素引起的心肌损伤[11].谷甾醇和豆甾醇是常见的植物类甾醇成分，对于降低心血管疾病有很好的疗效.其中，谷甾醇可减轻实验动物心脏及离体培养心肌细胞的氧化应激损伤，并通过抑制ERK1/2、上调Bcl-2/Bax来抑制心肌细胞的凋亡[12];而豆甾醇在这方面的研究相对较少，有待于进一步探讨其对心血管的保护作用和机制.

此外，绞股蓝皂苷为绞股蓝的主要成分，截至2017年已分离出201种绞股蓝皂苷单体[13]，且近几年仍有新的单体成分被分离和鉴定.结合本研究结果，发现与阿霉素心肌病相关的绞股蓝皂苷单体成分主要有绞股蓝皂苷XL、LXXIV、LXXIX和A_qt等，在保护非酒精性脂肪性肝病[14]、预防帕金森病[15]和促进肌细胞增殖[16]等方面显示出良好的活性.虽然上述单体成分在心血管疾病方面的治疗作用还未见报道，但目前的实验研究已证实绞股蓝总皂苷具有抗炎和抗氧化能力，并可通过激活AMPK信号通路来抑制miR-143-3p的水平进而保护心肌细胞[17].经绞股蓝总皂苷预治疗的实验动物，心肌细胞的凋亡和心肌缺血再灌注（I/R）损伤程度降低[6];此外，绞股蓝总皂苷也能够通过增强SERCA2a mRNA的表达及抑制Ca2+超载来改善阿霉素对心功能的影响[18].这与本文研究结果相吻合，可进一步探索.

由此可见，绞股蓝抗阿霉素心肌病的药效物质基础较广，可通过多成分、多靶点机制保护心肌细胞.此外，有些化合物，如绞股蓝黄酮等虽在网络中并未出现，但其分子机制及药理活性已被研究证实[19]，而其他有效活性成分有待于进一步挖掘.前述相关报道与本文研究结果也进一步证实了采用网络药理学探讨绞股蓝防治阿霉素心肌病的药效物质基础及分子机制具有一定的科学性.

3.2   药物防治疾病的潜在作用机制

为深入研究绞股蓝防治阿霉素心肌病的潜在作用机制，本研究对药物-疾病靶标进行PPI網络分析、GO功能分析和KEGG通路富集分析，发现活性成分发挥作用的潜在靶标有AKT1、TP53、TNF-α、CAPS3、IL-6等89个;主要参与的生物学过程有氧化应激、细胞凋亡调节、炎症因子刺激反应、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性调节等;富集分析排名靠前的有PI3K-Akt、AMPK信号通路、细胞凋亡和线粒体自噬[20]等多条信号通路.

阿霉素心肌病的发生和发展具有“单因素”、“多机制”的特点.心肌细胞钙超载、线粒体稳态失调、免疫激活等反应综合介导了阿霉素引起的心肌细胞的损伤和死亡[21].阿霉素[22]可通过激活心肌线粒体自噬、引起自由基爆发、破坏细胞内钙离子平衡并触发线粒体的渗透过度，导致线粒体外膜渗透性增强及凋亡启动分子的释放[23].在阿霉素心肌病实验动物模型中，激活AMPK和PI3K-Akt信号通路有利于维持心肌细胞内环境稳态，减轻细胞氧化应激和炎症反应，并维持线粒体功能的稳定，对于改善心脏结构和功能损伤有显著作用[23].有研究数据表明，绞股蓝总皂苷能抑制脂质过氧化和心室肌细胞Ca2+内流来维持心肌细胞的钙稳态[18]，也可以通过激活AMPK信号通路[17]，发挥心肌保护作用.较多研究证实，PI3K-Akt是抑制心肌细胞凋亡的关键信号通路[24]，激活Akt依赖信号通路可有效防治心肌细胞损伤.槲皮素可通过上调PI3K/AKT/mTOR通路减轻脓毒症实验动物的心肌组织炎症和氧化应激反应[25].此外，TP53通过端粒-线粒体轴维持mtDNA稳态，下调TP53的表达可减轻阿霉素导致的心肌线粒体损伤和细胞凋亡[26].适当抑制TNF-α的表达可以提高心肌细胞的抗氧化能力及抑制阿霉素诱导的细胞程序性死亡[21]，而采用谷甾醇预处理可有效降低TNF-α和IL-6的水平，缓解心肌炎症及氧化应激反应[27].本研究结果表明，绞股蓝活性成分可通过TP53、AKT1、TNF-α、IL-6等靶标来调控多种信号通路，发挥防治疾病作用.

4    结论

综上所述，本研究采用网络药理学的方法预测了绞股蓝防治阿霉素心肌病的复杂分子网络，绞股蓝中槲皮素、谷甾醇、绞股蓝皂苷等有效活性成分通过调控p53、TNF-α、Akt、AMPK等信号分子，参与细胞程序性死亡、氧化应激和线粒体稳态调控，从而达到防治阿霉素心肌病的目的.确定绞股蓝治疗阿霉素心肌病的各种调控靶标，进而分析其潜在作用机制，可为后续分子机制研究和相关药理学验证分析提供针对性的参考[28].网络药理学也存在诸如无法解决药物代谢动力学、一些常见的普通化合物频繁上榜（槲皮素、谷甾醇）、动物/细胞/分子药理与临床药理难以准确区分等问题，因此，文中部分预测结果及相关作用机制还需通过细胞、动物实验和临床研究进一步证实.

参考文献

[1]     LEFRAK E A，PITHA J，ROSENHEIM S，et al. A clinicopathologic analysis of adriamycin cardiotoxicity[J].Cancer，1973，32（2）：302-314.

[2]     苏毅馨，朱世杰，薛鹏，等.阿霉素心脏毒性的研究进展[J].临床肿瘤学杂志，2020，25（11）：1048-1054.

[3]     唐婷范，朱家庆，李荣彬，等.葛叶多酚的提取工艺及其抗氧化性质[J].广西科技大学学报，2021，32（2）：100-106.

[4]     沈子琳，王振波，侯会芳，等.绞股蓝的化学成分和药理作用及应用研究新进展[J].人参研究，2020，32（5）：59-64.

[5]     王云杉，王杰，王潇楠，等.绞股蓝总皂苷治疗高胆固醇血症及其对肝损伤的保护作用[J].中国药科大学学报，2021，52（1）：84-91.

[6]     YU H J，ZHANG H S，ZHAO W H，et al.Gypenoside protects against myocardial ischemia-reperfusion injury by inhibiting cardiomyocytes apoptosis via inhibition of CHOP pathway and activation of PI3K/Akt pathway in vivo and in vitro[J].Cellular Physiology and Biochemistry，2016，39（1）：123-136.

[7]     赵颖，胡大一.绞股蓝总皂甙对单个豚鼠心室肌细胞的钙、钠、钾电流及动作电位的影响[J].中国药理学通报，1998（1）：68-70.

[8]     PAN C L，L? H T.Preparative separation of quercetin，ombuin and kaempferide from gynostemma pentaphyllum by high-speed countercurrent chromatography[J].Journal of Chromatographic Science，2019，57（3）：265-271.

[9]     吴方评，金苹，蒲艳春，等.绞股蓝化学成分及对肾脏的保护作用研究[J].中国药物化学杂志，2020，30（3）：153-158.

[10]   吕海涛，潘从蕾，单虎.绞股蓝中槲皮素、商陆素和山奈素的提取工艺优化[J].食品工业，2019，40（9）：40-44.

[11]   SHARMA A，PARIKH M，SHAH H，et al. Modulation of Nrf2 by quercetin in doxorubicin-treated rats[J].Heliyon，2020，6（4）：e03803.

[12]   嚴宁，杨春霞，马娟，等.β-谷甾醇对大鼠心肌缺血再灌注损伤和ERK1/2信号通路的影响[J].心血管病学进展，2020，41（3）：321-325.

[13]   范冬冬，匡艳辉，向世勰，等.绞股蓝化学成分及其药理活性研究进展[J].中国药学杂志，2017，52（5）：342-352.

[14]   HONG M，CAI Z，SONG L，et al.Gynostemma     pentaphyllum attenuates the progression of nonalcoholic fatty liver disease in mice：a biomedical investigation  integrated with in silico assay[J].Evidence-based Complementary and Alternative Medicine，2018，2018：1-13.

[15]   JOH E H，YANG J W，KIM D H.Gypenoside LXXIV ameliorates scopolamine-induced learning deficit in mice[J].Planta Medica，2011，76（8）：793-795.

[16]   HA T K Q，PHAM H T T，CHO H M，et al. 12，23-Dione dammarane triterpenes from Gynostemma longipes and their muscle cell proliferation activities via activation of the AMPK pathway[J].Scientific Reports，2019，9（1）：1186.

[17]   CHANG L P，SHI R，WANG X J，et al.Gypenoside a protects ischemia/reperfusion injuries by suppressing miR-143-3p level via the activation of AMPK/Foxo1 pathway[J].Biofactors，2019，46（3）：432-440.

[18]   葛敏，刘国平，关宿东.绞股蓝总皂苷对阿霉素致心力衰竭大鼠心功能的影响[J].中国老年学杂志，2014，34（16）：4579-4582.

[19]   孙立峰，郭华，孟剑锋，等.绞股蓝总黄酮通过抑制氧化应激反应抗心肌缺血保护作用的研究[J].中华中医药学刊，2018，36（10）：2513-2515.

[20]   CALVELLI H，KRIGMAN J，ONISHI M，et al.Detection of mitophagy in mammalian cells，mice，and yeast[J].Methods in Cell Biology，2020， 155：557-579.

[21]   RENU K，GOPALAKRISHNAN A V，PICHIAH P B T，et al.Molecular mechanism of doxorubicin-induced cardiomyopathy - an update[J].European Journal of Pharmacology，2018，818：241-253.

[22]   段明霞，李文明，唐其柱.线粒体自噬相关蛋白在阿霉素诱导的心脏毒性中的表达及意义[J].中华老年心脑血管病杂志，2019，21（2）：172-176.

[23]   MA H，KONG J，WANG Y L，et al.Angiotensin-converting enzyme 2 overexpression protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy by multiple mechanisms in rats[J].Oncotarget，2017，8（15）：24548-24563.

[24]   甘家丽，曾妙，黄洋，等.中药基于PI3K/Akt信号通路防治心肌缺血/再灌注损伤的研究进展[J].中华中医药杂志，2020，35（7）：3527-3529.

[25]   吴柳，蒋永艳，刘微，等.槲皮素通过PI3K/AKT/mTOR通路减轻脓毒症小鼠心肌损伤[J].中国急救医学，2021，41（3）：238-243.

[26]   LI J，WANG P Y，LONG N A，et al.p53 prevents doxorubicin cardiotoxicity independently of its prototypical tumor suppressor activities[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2019，116（39）：19626-19634.

[27]   KOC K，GEYIKOGLU F，CAKMAK O，et al.The targets of β-sitosterol as a novel therapeutic against cardio-renal complications in acute renal ischemia/reperfusion damage[J].Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology，2020，394（3）：469-479.

[28]   丁华杰，叶云，高强，等.白藜芦醇处理乳腺癌细胞基因表达通路分析[J].广西科技大学学报，2019，30（2）：79-85，92.

Investigation of the pharmacodynamic material basis and molecular mechanism of gynostemma pentaphyllum in the treatment of adriamycin cardiomyopathy based on network pharmacology

WEI Weia， ZHANG Jijiea， LIU Zhongyia， GAO Si*b

（a. College of Science; b. Medical School， Guangxi University of Science and Technology，

Liuzhou 545006， China）

Abstract：  This study was to explore the pharmacodynamic basis and potential mechanism of             gynostemma pentaphyllum in the treatment of doxorubicin cardiomyopathy by using network           pharmacology of  Chinese medicine. The candidate pharmacological components of gynostemma     pentaphyllum were obtained by retrieving TCMSP， SYMMAP， TCMID data platforms， and the           potential action targets of candidate pharmacological components were obtained by Uniprot database. Cytoscape 3.8.1 software was used to construct the active component-target protein interaction network diagram. GeneCards and OMIM databases were used to screen out disease-related targets of             doxorubicin cardiomyopathy， and the protein interaction network of drug-disease genes was drawn by combining the String database. Metascape database was used for gene function analysis （GO） and KEGG pathway enrichment analysis of the intersection targets， so as to make a reasonable prediction on the mechanism of gynostemma pentaphylum improving doxorubicin cardiomyopathy. A total of 26 active components of gynostemma pentaphyllum related to adriamycin cardiomyopathy were screened out，   including quercetin， sitosterol， gynostemma pentaphyllum saponins， etc.， and 89 potential targets of    active components were identified， mainly including TNF-α， TP53， ATK1， IL-6， etc. The main        functions involved in the target included oxidative stress， apoptosis signal， inflammatory cytokine    stimulation response， regulation of protein serine/threonine kinase activity， etc. The main enrichment pathways included p53， TNF-α， PI3K-Akt， AMPK and other signaling pathways， as well as  mitochondrial autophagy and cellular calcium signal transduction pathways. The results showed that quercetin，      sitosterol， gypenoside and other active components of gynostemma pentaphyllum could regulate p53， TNF-α， Akt， AMPK and other signaling molecules to participate in the regulation of programmed cell death， oxidative stress and mitochondrial homeostasis， so as to achieve the purpose of prevention and treatment of doxorubicin cardiomyopathy.

Key words： gynostemma pentaphyllum; network pharmacology; doxorubicin cardiomyopathy;       pharmacodynamic material basis; molecular mechanisms

（責任编辑：黎   娅）