赵伟 刘希高 史本康 王磊

1山东省滕州市中心人民医院泌尿外科 277500；2山东大学齐鲁医院泌尿外科，济南250012

膀胱癌起源于膀胱上皮组织，是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，位列人类十大恶性肿瘤之一［1］，发病率高达6.61/100 000，在恶性肿瘤发病率中排名第9［2］。膀胱癌可以发生在任何年龄阶段，其发病率随年龄增长而增加，好发于50～70 岁（男女比例为 3∶1～4∶1）［3］。目前，常规检查包括膀胱镜、CT、B超和膀胱造影等。大约80%的膀胱癌患者可被早期诊断，且通过手术治疗，但5 年复发率仍达到50%～70%，其中仍有10%～30%的患者进展为肌层浸润性膀胱癌［4］。膀胱癌具有较强的侵袭力，患者的预后差，5 年生存率极低［5］。因此，寻找更可靠的生物标志物和更有效治疗靶标对于提高膀胱癌诊断率及改善膀胱癌患者的预后至关重要。

最新研究发现，约50%的microRNAs 具有与肿瘤发生相关的基因组定位，在人类许多肿瘤细胞中异常表达［6-7］。更多研究表明，microRNAs 在肿瘤的发生、进展和预后中起着重要作用［8-13］。这是因为microRNAs 是一类高度保守、非编码小RNA，在生理和病理过程中对基因的表达、蛋白功能的发挥具有重要的调控作用，在细胞的凋亡、分化和增殖中调节相关基因的表达水平［14］。它们不仅能诱导癌基因表达促进肿瘤形成，还可以抑制癌基因表达抑制肿瘤的形成［15］。相关研究发现microRNA-143 在宫颈癌和结肠癌等多种肿瘤中低表达［15］。

目前通过基因芯片最新研究发现，microRNA-143 在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达存在显著差异性，表明其可能在膀胱癌的发生进展中起重要作用［16］。本试验通过检测膀胱癌患者和正常人血清中microRNA-143的表达水平，并探讨了其临床意义与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 对从2013 年6 月至2016 年6 月在山东大学齐鲁医院、滕州市中心人民医院就诊的68 例膀胱癌患者（观察组，术后病理确诊）及40 例健康受试者（对照组，来自于体检中心）进行回顾性研究，并对观察组进行持续48 个月的随访。观察组男51 例，女17 例，年龄（54.5±6.7）岁；对照组男32 例，女8 例，年龄（54.8±8.6）岁。膀胱癌TNM 分期参考 UICC 第8 版（2017 年）［18］。两组均行腹部、泌尿系CT 和超声检查。所有患者或其家属和健康受试者均签署知情同意书。纳入标准：经病理诊断为膀胱癌的患者，且有完整临床资料。排除标准：患有尿路感染者；肝肾功能严重受损的患者；接受过放化疗和生物靶向治疗者；近期使用过大量糖皮质激素或免疫抑制剂者；合并有其他部位肿瘤或家族遗传性恶性肿瘤的患者；患有严重脑、心、肺疾病者。

本研究已通过滕州市中心人民医院伦理委员会审批（伦审号：2020-伦理审查-18），通过山东齐鲁医院伦理委员批准。

1.2 主要试剂和仪器 miRcute miRNA 提取和分离试剂盒、cDNA 第一链合成试剂盒及Trizol 试剂（TRI ReagentBD，Molecular Research Center 公司，美国）；实时荧光定量 PCR 仪（（SYBR Green PCR kit，ABI 7500，American ABI 公司，美国）；Mir-UV 紫外可见分光光度计（K5600，北京凯奥科技发展有限公司，中国）；microRNA-143（正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTGAGATGAAGCACT-3'，反向引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'）与内参U6（正向引物：5' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3'， 反 向 引 物 ：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3）的引物（上海圣工生物技术有限公司，中国）。

1.3 检测方法 观察组与对照组血清样品的收集和储存：均无菌采取4 ml新鲜血液，离心后，将血清置于EP 试管中并保存在-70 ℃直至使用。提取血清总RNA：将从冰箱中取出的血清样本立即在37 ℃水浴中融化2 min，再取300µl 血清根据miRcute miRNA 试剂盒说明进行提取和分离处理。反转录：根据miRcute miRNA cDNA 第一链合成试剂盒使用说明进行操作。反应条件为：16 ℃，30 min→42 ℃，30 min→85 ℃，5 min。RT-PCR：构建20 µl 的 cDNA扩增反应体系：95 ℃，10 min 预变，95 ℃，10 s 变性，60 ℃，20 s 退火，72 ℃，10 s 延伸，共 40 个循环。之后继续在 72 ℃延长5 min。U6作为内参。全部试验均重复3次，采用2-ΔΔCt表示microRNA-143的相对表达量。

1.4 随访 通过电话或门诊方式对患者进行随访48个月，分析microRNA-143的相对表达水平与患者的预后指标的关系。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0 版统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计数资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，不同临床病理参数间的microRNA-143 表达情况以百分数表示，行χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较 两组研究对象的性别、年龄、吸烟、饮酒、体质量指数一般资料比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 两组研究对象一般资料比较

2.2 观察组与对照组的血清microRNA-143 表达水平的比较 观察组血清microRNA-143 的相对表达量为（0.68±0.32），对 照 组 为（0.87±0.26）。 观 察 组 血 清microRNA-143 的相对表达量显著低于对照组（t=3.186，P=0.002）。

2.3 膀胱癌患者血清microRNA-143 的表达水平与各临床参数的关系分析 结果显示不同性别、年龄的膀胱癌患者血清miR-143 表达水平差异均无统计学意义（均P＞0.05）；而不同病理分级、是否远处转移、是否淋巴结转移、不同临床分期的膀胱癌患者血清microRNA-143 表达水平差异均有统计学意义（均P＜0.05），如表2所示。

表2 68例膀胱癌患者血清microRNA-143的表达水平与各临床参数的关系

2.4 膀胱癌患者血清microRNA-143 的表达水平与其预后关系分析 随访结果符合正态分布：膀胱癌患者血清microRNA-143 的相对表达量中位数是0.652，以此为界分为高表达组与低表达祖，各34 例患者。对两组患者进行生存时间随访发现，低表达组患者的生存时间为（37.53±1.85）个月，显著低于高表达组患者的生存时间（44.97±2.00）个月，差异有统计学意义（t=2.73，P=0.008）。

3 讨 论

目前为止，手术仍然是膀胱癌的主要治疗方法，可辅助以放疗、化疗等其他治疗方法。然而，仍然面临着预后差、术后复发率高、术后生活质量较差等问题［18］。据诸多学者研究，发现了部分膀胱癌肿瘤标志物有助于膀胱癌的诊断与监测，但仍未全面、完善地应用于临床。其中miRNA 便是可作为肿瘤诊治、监测及预后评判的潜在标志物之一［19］。部分学者指出大约50%的人类肿瘤的发生进展与miRNA的表达密切相关［20］。自从2007 年首次发现膀胱癌与miRNA 的表达相关后，研究miRNA 在膀胱癌的发生进展中的作用便成为热点［21］。已有研究显示microRNA-143 在子宫肌层、血管平滑肌细胞、破骨细胞和脂肪细胞中高表达，其中microRNA-143能够抑制血管平滑肌细胞的增殖，起着保持平滑肌细胞和血管之间平衡的作用［22-25］。近年来，研究发现microRNA-143在肿瘤的发生、发展中也起着重要作用。有研究发现microRNA-143-3p 通过在肿瘤的增殖、凋亡和癌细胞的上皮-间质转化等机制中起作用，对口腔鳞状细胞癌的发生及进展起到了抑癌基因的作用［26］。

在本研究中，应用实时荧光定量PCR 检测血清microRNA-143 的表达水平，结果表明，膀胱癌患者血清microRNA-143 表达水平明显低于健康受试者。这与许多研究消化系统恶性肿瘤中microRNA-143 表达情况是一致的，其中包括食道癌［27］、胃癌［29-30］、胰腺癌［30］和结肠癌［31-32］。基于此，可以推断microRNA-143 在膀胱癌的发生、进展中起到了抑制基因的作用。同时，从本研究结果可以看出，膀胱癌患者血清microRNA-143 的表达水平随着临床分期的升高而逐渐降低，这提示microRNA-143表达下调可能与膀胱癌的发生和发展密切相关。根据随访结果和生存分析，膀胱癌患者血清microRNA-143 的表达水平中位数是0.652，以此中位数为界分为高表达组与低表达组，血清microRNA-143 低表达的膀胱癌患者的生存时间为（37.53±1.85）个月，明显低于高表达的膀胱癌患者生存时间（44.97±2.00）个月，两者生存率比较差异有统计学意义（P＜0.05），表明血清microRNA-143低表达膀胱癌患者的预后较差。

本课题为回顾性研究，在基本情况数据、临床检查、特殊检查和其他数据的调查中存在着一定的不完整性。另外，由于样本量较小，本课题数据统计分析不够充分，因此仍需进一步扩大了样本量、收集相关数据、完善实验研究与统计学方法，以便获得更精确的实验结果。

综上所述，膀胱癌患者血清microRNA-143的表达水平明显低于健康受试者，且与临床分期、病理分级、淋巴结转移、远处转移和预后有着密切关系，其中膀胱癌患者血清microRNA-143 高表达者预后较好，提示microRNA-143 有望成为诊断膀胱癌诊断和监测的潜在标志物。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。