张伟铮 阿依姑再·艾力 邓光远 李松 张轩 黄彬 蔡依玫

1广州市干部健康管理中心广州市第十一人民医院医学检验科 510530；2广州中医药大学基础医学院 510006；3广州中医药大学第二附属医院广东省中医院检验医学部510006；4中山大学附属第一医院检验医学部，广州 510075

肠杆菌目细菌（Enterobacterales）是一种无芽孢、周身鞭毛或无鞭毛的革兰阴性杆菌，通常可引起肠道、泌尿道、胆道、腹腔及血流感染（菌血症和败血症）［1］。碳青霉烯类药物是治疗多重耐药菌感染的首选药物。近几十年来，随着临床抗菌药物的广泛使用，碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（carbapenem-resistantEnterobacterales，CRE）的数量明显增多，现如今已成为院内感染的高危病原菌［2］。CRE 因耐药性强和致死率高，被称为“超级细菌”。CRE 的耐药机制主要是细菌自身产生的碳青霉烯酶［3-6］，其次是超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）和/或AmpC 酶过度表达合并膜孔蛋白缺失、外排泵过表达和药物靶位改变［7］。碳青霉烯酶按Ambler 分子分类为A、B、D 3 类酶。A类为丝氨酸酶，KPC 是最具临床意义的A 类酶；B 类为金属β-内酰胺酶，是研究最多的碳青霉烯酶，主要包括NDM、IMP和VIM；D类也属于丝氨酸酶，主要是OXA-48。碳青霉烯酶的临床检测方法包括聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、改良Hodge 试验、Carba NP 试验、改良碳青霉烯灭活试验（modified carbapenem in activation method，mCIM）、EDTA 碳青霉烯灭活试验（EDTA-modified carbapenem in activation method，eCIM）和免疫层析法等［8］。mCIM 联合eCIM 可以区分碳青霉烯酶是产A 类丝氨酸酶或产B 类金属β-内酰胺酶，相对于Carba NP 和MHT，它操作简便、价格低廉且已获得美国临床实验室标准化协会（clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）认可［9］。其主要缺点是孵育时间长，总耗时长。商品化免疫胶体金试剂盒是通过碳青霉烯酶抗原与胶体金标记的抗体结合形成抗原抗体复合物，通过层析作用而显色的一种试剂盒。现如今国外已有NG-Test CARBA 5试剂盒［10］。该试剂盒可以直接检测5 类常见的碳青霉烯酶（KPC、NDM、IMP、VIM 和OXA-48），操作简便快速，可是成本较高。本实验使用的商品化免疫胶体金试剂盒检测单个类型的碳青霉烯酶试剂盒，相较于NG-Test CARBA 5，该试剂盒可依据菌种特征，优先选择不同的碳青霉烯酶单独测试，相对成本较低，利于常见表型（如KPC 和NDM 酶）的检出，指导临床合理用药。本研究通过对免疫胶体金试剂盒的性能评价，评估其能否广泛应用于临床碳青霉烯酶的检测。

1 实验材料

1.1 菌株 收集广东省2 家三甲医院2016 年1 月至2020 年 12 月临床分离的 88 株 CRE（广东省中医院 64 株，中山大学附属第一医院24 株），剔除来自同一患者的重复株。所有菌株经全自动微生物分析仪Vitek 2 鉴定和药敏测试。根据CLSI M100-S31 指南，CRE 对厄他培南、亚胺培南或美罗培南任一药物耐药。质控菌株选用大肠埃希菌ATCC 25922。所有菌株用25% 甘油-LB 肉汤保种，-80 ℃冻存，实验前用血平板复苏备用。

1.2 试剂 血平板、MH 平板（广州迪景微生物科技有限公司），PCR 扩增试剂、DNA Marker DL 2000（日本TakaRa公司），PCR 引物、乙二胺四乙酸（EDTA）、NaOH 结晶（生工生物工程上海股份有限公司），Glodview 荧光染料（广州东盛/民赛生物科技有限公司），免疫胶体金试剂盒（北京金山川科技发展有限公司），美罗培南药敏纸片10 µg/ml、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（英国Oxoid公司）。

1.3 仪器 Veriti PCR 扩增仪（美国ABI 公司），DIYY-6C 型水平电泳仪（北京六一仪器厂），Vilber Lourmat凝胶成像系统（法国Vilber Lourmat公司）。

2 实验方法

2.1 菌株的复苏 用接种环挑取一环菌液，分区划线接种于血平板，35 ℃培养16～18 h，观察菌落生长情况，挑单克隆接种于含100 µg/ml 氨苄西林的LB 平板，30 ℃培养16～18 h。

2.2 碳青霉烯酶基因检测

2.2.1 细菌DNA的提取 将新鲜细菌悬浮于100µl灭菌双蒸水中，充分混匀，100 ℃煮沸10 min；12 000 r/min 离心5 min（离心半径15 cm），将上清液转移至新的无菌EP管，-80 ℃冻存备用。

2.2.2 PCR 扩增 ⑴PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 40 s，退火 50 s，72 ℃延伸 50 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 检测碳青霉烯酶基因的引物序列和扩增片段长度见表1。⑵电泳：将扩增产物加入至1%琼脂糖凝胶孔中，在150 V电压下电泳25 min后在凝胶成像系统中拍照，以DNA Marker2000 作为分子量标准，出现与阳性对照分子量相同的条带判为阳性。阳性PCR扩增产物送上海生物工程技术有限公司测序验证，并进行Blast 同源序列比对分析。

表1 碳青霉烯酶基因所用引物序列及扩增片段长度和退温温度

2.3 mCIM 联合 eCIM 采用 mCIM 联合 eCIM 检测88 株CRE 是否产碳青霉烯酶。mCIM 联合eCIM 参照第31版M100《抗菌药物敏感性试验性能标准》［11］。

2.3.1 mCIM 称取30 g TSB 干粉溶于1 L 去离子水，121 ℃高压灭菌15 min 备用。挑取1µl 接种环的新鲜菌落充分溶于2 ml TSB 肉汤，放入1 张含10µg 美罗培南药敏纸片，37 ℃孵育4 h。取出纸片并尽量挤去多余水分，贴于已均匀涂布0.5 MCF 大肠埃希菌ATCC 25922 的MH 琼脂平板，37 ℃5%CO2培养18～24 h后测量抑菌圈直径。结果判读：美罗培南抑菌圈直径6～15 mm 或16～18 mm 且抑菌圈中有菌落生长判定为产碳青霉烯酶；抑菌圈直径≥19 mm 判定为不产碳青霉烯酶；抑菌圈直径16～18 mm 或≥19 mm 且抑菌圈中有菌落生长，则无法判定是否产碳青霉烯酶。

2.3.2 eCIM 取1 µl 接种环的新鲜菌落充分溶于含20 µl PH8 0.5 M EDTA 的 2 ml TSB 肉汤，放入 1 张含 10 µg美罗培南药敏纸片，37 ℃孵育4 h。随后将两实验的MEM纸片贴在同一块均匀涂布0.5 MCF大肠埃希菌ATCC 25922的MH 琼脂平板，37 ℃ 5%CO2培养 18～24 h 后测量抑菌圈直径。结果判读：当mCIM 结果为阳性时，若eCIM 试验纸片与mCIM 试验纸片的抑制圈直径≥5 mm，则判为产金属β-内酰胺酶阳性菌；若两者的抑菌圈直径差≤4 mm，则判为产丝氨酸酶。

2.4 免疫胶体金试剂盒 根据基因型结果，应用4 种商品化免疫显色试剂盒检测碳青霉烯酶。30 株携带blaKPC、24 株携带blaNDM、9 株携带blaIMP-4和 5 株携带blaVIM的 CRE 分别用 KPC、NDM、IMP-4 和 VIM 酶试剂盒进行检测；20 株PCR 阴性的CRE 作为对照组，同时用4 种酶试剂盒进行检测。 由于未检出携带blaOXA-48的 CRE，本实验未对OXA-48酶试剂盒进行检测。

免疫胶体金试剂盒操作步骤如下：向无菌EP 管中滴入10滴样本处理液，用一次性接种环蘸取过夜培养细菌菌落，插入滴有样本处理液的无菌EP 管中，充分搅拌使其与溶液混匀，取50µl 处理后的样本加至胶体金检测盒的加样孔，10 min 后读取结果。在检测卡的检测区域中出现2 条红色条带，即结果为阳性。

3 结 果

3.1 PCR 检测碳青霉烯酶基因 88 株 CRE 中，共检出6 种常见的肠杆菌目细菌，包括43 株肺炎克雷伯菌（48.9%），20 株大肠埃希菌（22.7%），18 株阴沟肠杆菌（20.5%），3 株产气克雷伯菌（3.4%），3 株弗氏柠檬酸杆菌（3.4%）和1 株粘质沙雷菌（1.1%）。88 株CRE 中，68 株碳青霉烯酶基因阳性，包括30 株携带blaKPC，24 株携带blaNDM，9 株携带blaIMP-4以及 5 株携带blaVIM，未检出blaOXA-48基因，见表2。5种碳青霉烯酶基因电泳结果见图1。

图1 5种碳青霉烯酶基因聚合酶链式反应产物电泳结果。A、B、C、D、E分别为blaKPC、blaNDM、blaIMP-4、blaVIM、blaOXA-48阳性菌电泳结果

表2 88株碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌的菌种鉴定和碳青霉烯酶基因分布（株）

3.2 mCIM 联合 eCIM 检测碳青霉烯酶 88 株 CRE 中，mCIM 阳性 66 株，2 株分别携带blaNDM和blaIMP-4的阴沟肠杆菌为假阴性。采用微量肉汤稀释法验证这2 株菌的耐药表型，2 株菌对IPM 的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations，MICs）均为8 µg/ml，对美罗培南的MICs 分别为 8 µg/ml 和 4 µg/ml。20 株 CRE 中，mCIM 阴性，推测这20 株不产碳青霉烯酶CRE 的耐药机制与ESBL/AmpC 酶合并膜孔蛋白缺失以及外排泵过表达相关。mCIM 灵敏度和特异度分别为97.1%（66/68）和100.0%（20/20）。mCIM 联合eCIM 检出36株产金属β-内酰胺酶和30株产丝氨酸酶。这36 株产金属 β-内酰胺酶的 CRE 中，23 株携带blaNDM，8 株携带blaIMP-4，5株携带blaVIM。mCIM联合eCIM能准确鉴定金属β-内酰胺酶，结果见表3。部分菌株mCIM 联合eCIM 结果见图2。

图2 部分碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌mCIM 联合eCIM 结果。A、B、C 分别为产金属β-内酰胺酶、产丝氨酸酶和不产碳青霉烯酶菌株mCIM联合eCIM结果

表3 88株碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌mCIM联合eCIM与聚合酶链式反应结果比较

3.3 免疫胶体金试剂盒检测碳青霉烯酶 免疫胶体金试剂盒检测68 株产碳青霉烯酶和20 株不产碳青霉烯酶的CRE。以PCR 为金标准，免疫胶体金试剂盒的总体灵敏度和特异度分别为98.5%（67/68）和100.0%（20/20），阳性预测值为100.0%（67/67），阴性预测值为95.2%（20/21），总符合率为98.9%（87/88）。KPC 酶试剂盒的灵敏度和特异度为100.0%（30/30）和100.0%（20/20）；NDM 酶试剂盒的灵敏度和特异度为100.0%（24/24）和100.0%（20/20）；IMP-4酶试剂盒的灵敏度和特异度为88.9%（8/9）和100.0%（20/20）；VIM酶试剂盒的灵敏度和特异度为100.0%（5/5）和100.0%（20/20）。1 株携带blaIMP-4的阴沟肠杆菌为假阴性，该菌mCIM 初筛试验也为假阴性，经耐药表型复核，推测与IMP-4酶低表达量有关。然而，增加菌液浓度进行进一步实验，结果仍为阴性。免疫胶体金试剂盒与PCR 结果对比见表4，部分菌株免疫胶体金试剂盒见图3。Fisher 精确检验显示，免疫胶体金试剂盒和mCIM 联合eCIM 差异无统计学意义（P＜0.001）。

图3 部分碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌免疫胶体金试剂盒检测结果。A、B、C、D 分别为KPC、NDM、IMP-4、VIM 酶胶体金试剂盒检测结果

表4 88株碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌免疫胶体金试剂盒与聚合酶链式反应结果比较

3 讨 论

随着临床抗菌药物的广泛使用，耐碳青霉烯肠杆菌的检出数量日益增多［12］，现如今已成为院内感染的重要病原菌，而临床对于这类细菌的感染治疗可选择药物非常有限，并且不同基因型的治疗方案也不同。例如，产KPC 的肺炎克雷伯菌对头孢他啶/阿维巴坦的敏感性较好，相反，产金属β-内酰胺酶的大肠埃希菌和阴沟肠杆菌对其敏感性较差［13］。因此，对碳青霉烯酶基因型的鉴定可以早期有效地指导临床合理用药。

本研究收集了2 家三甲医院临床分离的88 株CRE，包括6 种常见肠杆菌（肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气克雷伯菌和粘质沙雷菌）。经PCR 鉴定，88株CRE 中，共68株携带碳青霉烯酶基因，包括30 株携带blaKPC，24 株携带blaNDM，9 株携带blaIMP-4，5 株携带blaVIM。88 株CRE 中，有20 株碳青霉烯酶基因阴性，推测这些菌株耐药机制可能与罕见/新型碳青霉烯酶、ESBL 和/或AmpC酶合并膜孔蛋白缺失以及外排泵过表达相关［14］。

mCIM 灵敏度和特异度分别为97.1%（66/68）和100.0%（20/20），2 株分别携带blaNDM和blaIMP-4的阴沟肠杆菌为假阴性。实验菌株接种于含100 µg/ml 氨苄西林的LB 平板上，可排除质粒丢失引起的假阴性。同时，经微量肉汤稀释法进行耐药表型复核，2株菌对IPM的MICs均为8µg/ml，对美罗培南的 MICs 分别为 8 µg/ml 和 4 µg/ml，故推测 mCIM 假阴性与金属β-内酰胺酶的低活性相关。本实验中，mCIM联合eCIM 能正确鉴别肠杆菌的金属β-内酰胺酶和丝氨酸酶，操作简便，结果易于判断，在临床检测产碳青霉烯酶（尤其是KPC酶和NDM酶）CRE具有较高的应用价值［15］。

免疫胶体金试剂盒的总体灵敏度和特异度分别为98.5%（67/68）和100.0%（20/20），阳性预测值为100.0%（67/67），阴性预测值为 95.2%（20/21），总符合率为 98.9%（87/88）。KPC、NDM 和VIM 酶试剂盒的灵敏度和特异度均为100.0%。IMP-4 酶试剂盒的灵敏度和特异度分别为88.9%（8/9）和100.0%（20/20）。免疫胶体金试剂盒和mCIM 联合eCIM 试验差异无统计学意义（P＜0.001）。与mCIM 联合eCIM 试验相比，免疫胶体金试剂盒检测碳青霉烯酶的灵敏度和特异度高，操作更为简便，且10 min 内即可查看结果。该方法可用于快速辅助鉴定碳青霉烯酶的基因型，但阳性或阴性的结果不能否定存在其他耐药性机制的可能。不同于NG-Test CARBA 5，本实验使用的免疫胶体金试剂盒是能检测单个类型的碳青霉烯酶试剂盒，对于高风险耐药菌（如肺炎克雷伯菌）中特定碳青霉烯酶基因的检测，其相对成本大大降低［16］。

免疫胶体金试剂盒利用抗原抗体免疫层析技术快速检测肠杆菌中的碳青霉烯酶。受方法学影响，免疫胶体金试剂盒出现假阳性主要与非特异抗原干扰相关，而出现假阴性的原因主要包括：⑴细菌酶产量不多，抗原浓度低；⑵抗原浓度太高引起钩状效应；⑶后带反应。本研究中1 株携带blaIMP-4的阴沟肠杆菌为假阴性，该菌mCIM 初筛试验也为假阴性，经耐药表型复核鉴定为CRE，推测假阴性与IMP-4 酶低表达量有关。然而，增加菌液浓度进一步进行实验，结果仍为阴性。

由于不同碳青霉烯酶流行率不同，本研究采用非随机对照试验，实验菌株所携带的碳青霉烯酶基因分布存在偏倚。前期采用PCR 广泛筛选临床分离CRE 时发现，本地区携带blaIMP-4和blaVIM的CRE 数目有限。因此，本实验仅纳入9株携带blaIMP-4和5株携带blaVIM的CRE进行实验，这对检测结果造成一定的偏差。由于未检出携带blaOXA-48的CRE，本实验未对OXA-48酶试剂盒进行检测。

综上所述，免疫胶体金试剂盒（尤其是KPC 和NDM 酶试剂盒）在肠杆菌中灵敏度和特异度均很高，快速、有效且经济，能指导临床尽早启动有针对性的抗感染治疗方案，有望成为临床和实验室快速检测和诊断CRE的新方法。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。