孙涛，杨晓玉，冒韵东，蔡令波，刘嘉茵

(南京医科大学第一附属医院临床生殖医学中心 南京医科大学生殖医学国家重点实验室，南京 210029)

卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术是人为将精子直接注射入卵母细胞质以达到受精的目的，该技术为男性不育患者带来了希望。尽管，ICSI技术可以取得较高的受精率和卵裂率，但仍有1%～5%的患者可能发生完全受精失败(total fertilization failures，TFF)，并在临床中反复发生，这一问题给医生和患者带来了一定压力[1]。有研究表明，40%的ICSI受精失败归因于卵母细胞激活失败(oocyte activation failure，OAF)[2]。辅助卵母细胞激活(artificial oocyte activation，AOA)可以有效治疗因OAF引起的受精失败，并获得正常发育的胚胎[3]。由于钙离子载体AOA具有非侵入性和操作便利性，其在临床上应用最为广泛。

目前，钙离子载体AOA对行ICSI时未受精或受精低下患者的作用效果尚没有大规模临床研究，对子代安全性问题也存在争议[4]。钙离子载体能否提高第1个ICSI周期AOA助孕患者的受精率，既往的研究也比较少。因此，本文回顾性分析了本中心行ICSI时采用钙离子载体(A23187)AOA助孕患者的临床资料，通过分析临床妊娠结局及新生儿健康情况，以评估该技术的有效性和安全性，为以后深入研究钙离子载体AOA对子代长期安全性的影响提供参考，以期更好地服务于临床。

资料与方法

一、研究对象及分组

回顾性分析2012年1月至2020年12月于我院因受精不良或精子因素行ICSI助孕时使用钙离子载体AOA患者的临床资料。本研究共纳入115个激活周期。根据采用钙离子载体AOA的时间不同分为2组：第1个ICSI周期使用钙离子载体AOA助孕的为A组(n=66)和第2个ICSI周期才使用钙离子载体AOA助孕的为B组(n=49)。同时，以同期于我中心就诊的未使用激活剂的不同精子来源ICSI周期为A组的对照组，以自身既往未使用激活剂的ICSI周期为B组的对照组。

AOA患者纳入标准：成熟的卵母细胞≥3枚；行ICSI；行ICSI时采用了钙离子载体(A23187)AOA助孕。A组对照组的纳入标准：成熟的卵母细胞≥3枚；行常规ICSI；配偶精子活力差、畸形率高，配偶为无精子症时采用手术取精。排除标准：成熟的卵母细胞<3枚，卵母细胞质量差或畸形。

本研究数据来源于我院临床生殖医学管理系统数据库(CCRM)。

二、研究方法

1.控制性促排卵：根据患者情况选择长方案或拮抗剂方案。当优势卵泡(直径≥18 mm)达50%或雌激素达3 000 pmol/L时，肌内注射5 000～10 000 U HCG(珠海丽珠)，36～38 h后在阴道B超引导下穿刺取卵[5]。

2.精液收集和处理：按照本中心常规流程，少弱精子症患者采用手淫法收集精液，精液液化后，采用单层梯度离心或300g室温离心15 min，将沉淀下来的精子混匀，备用。无精子症患者通过外科手术穿刺附睾和睾丸获取样本，300g室温离心10 min，将沉淀下来的精子混匀，备用。

3.ICSI助孕：对照组卵母细胞按常规ICSI流程处理[6]。采用钙离子载体AOA的卵母细胞在行常规ICSI注射30 min后，转入钙离子载体A23187激活液(C9275-1MG，Sigma，美国)中，在37℃、6%CO2培养箱中孵育15 min，之后转入卵裂培养液(Cleavage Medium，Cook，美国)中继续培养。

4.卵裂期胚胎和囊胚评分标准：(1)卵裂期胚胎评分。根据卵裂球数目、形态和碎片情况对D3胚胎进行评分[5]，具体分为4级：Ⅰ级：胚胎发育速度正常，卵裂球均匀、数目均等，细胞质均一、无空泡，碎片<5%；Ⅱ级：胚胎发育速度正常，卵裂球均匀或大致均匀，数目均等或大致均等，细胞质均一、无空泡，碎片5%～10%；Ⅲ级：胚胎发育速度大致正常，卵裂球不均匀或均匀、数目不均等或均等，细胞质中有少量空泡，碎片10%～15%；Ⅳ级：胚胎发育速度异常，卵裂球不均匀、数目不均等，细胞质不均一、有大量空泡，碎片15%～50%。评分为Ⅰ级和Ⅱ级的为优质胚胎，Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级胚胎为可移植胚胎。根据D3胚胎评分和患者雌激素水平及内膜厚度，选择1～2枚胚胎进行移植，移植后常规黄体支持。对于移植后有剩余胚胎的患者，经其知情同意后行囊胚培养或胚胎冷冻。(2)囊胚评分。本中心囊胚评分采用Gardner评分系统[7]，评分级别高于CC的囊胚，可以移植或冷冻；评分低于CC的囊胚，其胚胎发育潜能降低，根据情况决定是否移植或冷冻。

5.临床结局判断：移植后14 d检测血β-HCG，若β-HCG≥25 U/L为阳性；移植4周后行超声检查，见原始心管搏动及孕囊判定为临床妊娠；妊娠12周内胚胎停止发育或发生妊娠物排出则诊断为早期流产；妊娠满28周且至少有1个存活新生儿定义为活产。随访至胎儿出生，记录妊娠患者分娩情况及胎儿情况。

6.观察指标：比较各组的一般资料和临床结局。2PN受精率=2PN卵母细胞数/ICSI注射MⅡ卵母细胞数×100%；2PN卵裂率=卵裂胚胎数/2PN卵母细胞数×100%；优质胚胎率=优质胚胎数/2PN卵母细胞数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；胚胎种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%；活产率=活产数/移植周期数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、患者的基本临床资料比较

两组间女方平均年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、基础FSH值和E2水平比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 患者基本临床资料比较(-±s)

二、A组患者中不同精子来源两组与对照组临床结局比较

A组患者根据不同精子来源分为2个亚组，采用外科手术穿刺获取的精子为手术组，采用手淫法获取的精子为严重少弱精子症组；并以同期于我中心就诊的未使用激活剂的不同精子来源ICSI周期作为对照组。比较两组中激活组和对照组的实验室指标及妊娠结局。

在手术组和严重少弱精子症组中，激活组2PN受精率均显著高于同组对照组(P<0.05)，而促性腺激素(Gn)使用总量、Gn使用天数、获卵数、MⅡ卵数、2PN卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率和胚胎种植率比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 A组患者中不同精子来源两组与对照组实验室指标及妊娠结局比较[(-±s)，%]

三、B组患者中不同既往ICSI情况组与对照组临床结局比较

B组患者根据第1次ICSI受精情况不同分为3个亚组：前次ICSI助孕受精失败(非精子因素)的为未受精组(n=12)，前次ICSI助孕受精率低的为受精低下组(n=31)和前次ICSI助孕因精子质量差导致受精失败的为精子因素组(n=6)；并分别以自身既往未使用激活剂的ICSI周期为对照组。比较3组中激活组和对照组的实验室指标及妊娠结局。

在未受精组中，对照组无正常受精卵形成，而激活组2PN受精率高达73.26%，并最终有8例活产；受精低下组中，激活组2PN受精率和2PN卵裂率均显著高于对照组(P<0.05)，而获卵数、MⅡ卵数、优质胚胎率、临床妊娠率和活产率比较均无显著性差异(P>0.05)；精子因素组中，激活组2PN卵裂率显著高于对照组(P<0.05)，而获卵数、MⅡ卵数、2PN受精率、优质胚胎率、临床妊娠率和活产率比较均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 B组患者中不同既往ICSI情况组与对照组实验室指标及妊娠结局比较[(-±s)，%]

续表

四、新生儿出生情况

在采用钙离子载体(A23187)AOA的115个周期中，共有22例患者顺利分娩24例活产儿，其中20例单胎，2例双胎，单胎和双胎平均孕周分别为(38.35±1.76)周和(32.50±2.12)周，单胎和双胎婴儿的平均出生体重为(3 466.00±482.19)g和(2 030.00±608.11)g，24例活产儿中有1例早产儿(31周)，其余均为足月儿，新生儿出生时健康状况良好，未见先天缺陷和畸形。

讨 论

本文研究结果表明，在采用钙离子载体AOA后，严重少弱精子症和手术取精患者2PN受精率显著提高(P<0.05)，且既往ICSI未受精或受精低下患者2PN受精率和卵裂率也显著提高(P<0.05)，最终增加了患者移植成功的希望。

在正常受精过程中，精子进入卵母细胞后，精子特异性磷脂酶C-zeta(PLC-ζ)会导致卵母细胞内的钙离子浓度发生持续数小时短暂升高，这个过程被称为卵母细胞的“钙震荡”[8]。卵母细胞钙震荡会引发大量生化反应事件，如释放皮质颗粒、重排细胞骨架、募集母系mRNA以及形成原核，这个过程称为卵母细胞激活。激活后的卵母细胞会启动受精过程并完成第2次减数分裂，排出第二极体，开启后续的胚胎发育过程[9]。哺乳动物受精后，钙震荡是卵母细胞激活的直接原因[10]。研究表明，触发钙震荡的PLC-ζ是引起正常受精的关键分子[11]。精子PLC-ζ异常表达和定位会导致未受精或受精低下[12-13]。

根据导致OAF的原因不同可分为精源性和卵源性因素。精源性因素主要是精子特异性卵母细胞激活因子异常，卵源性因素主要是卵母细胞激活信号通路异常[2]。PLC-ζ是主要的精子特异性卵母细胞激活因子，精子PLC-ζ低水平表达是导致受精失败的主要原因之一。Tavalaee等[12]检测了32例因DPY19L2基因缺失导致圆头精子症患者的精子，发现PLC-ζ在mRNA水平和蛋白水平的表达水平均低于正常男性。卵母细胞成功激活除了PLC-ζ还需要4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)、三磷酸肌醇受体(IP3R)、蛋白激酶C和钙离子等卵母细胞激活信号通路相关物质的参与，其中任何一个环节的出错都可能导致OAF的发生[14-15]。

当卵母细胞存在激活障碍时，可采用AOA。AOA主要包括物理激活法、化学激活法和电刺激法。而应用钙离子载体A23187的化学激活法是目前最常用的方法。严重少弱精子症患者采用ICSI并联合钙离子载体AOA助孕可获得正常受精胚胎，最终获得临床妊娠[6]。AOA还可应用于圆头精子症、不活动精子和严重形态异常精子患者行ICSI[12]。本研究发现，行ICSI采用钙离子载体AOA后，严重少弱精子症组和手术组2PN受精率均显著提高(P<0.05)。虽然行ICSI时采用钙离子载体AOA显著提高了受精率，但临床妊娠率和胚胎种植率并没有得到显著提高(P>0.05)，因此，对于严重少弱精子症治疗周期使用钙离子载体AOA可能需要进一步研究。一项Meta分析发现，钙离子载体AOA可以提高ICSI周期的受精率、临床妊娠率和活产率等[16]。既往ICSI周期的受精率情况是衡量是否需要AOA的重要指标之一。有研究提示，对于上个ICSI周期受精率>30%的患者，行ICSI-AOA助孕后患者的受精率和临床妊娠率得到显著提高[17]。本研究发现，钙离子载体AOA对既往ICSI周期未受精、受精低下(≤30%)患者的受精率、卵裂率、临床妊娠率和活产率均有显著提高作用，与既往的研究结果[18-19]一致。这也证明了通过钙离子载体AOA可以提高行ICSI时未受精或受精低下患者的临床妊娠机会。

由于钙离子载体AOA只能激发产生单个瞬时的钙离子峰，无法完全模拟自然受精生理过程中的钙离子周期性震荡和频率。这可能会改变钙离子调控通路下游特殊蛋白和酶的活性，影响胚胎的形成和发育。目前，钙离子载体AOA是否安全仍需要更多的深入研究。Long等[18]的一项Meta分析发现，ICSI-AOA与传统的ICSI比较，新生儿先天缺陷或先天缺陷类型(染色体畸变和非染色体畸变)患病率没有显著差异。Vanden Meerschaut等[19]对21例行ICSI-AOA获得的新生儿进行随访发现，新生儿在语言和神经发育方面均在正常范围内。本研究发现，利用钙离子载体AOA技术分娩的子代，在孕周、出生性别比、新生儿体质量方面均未见显著异常。在本研究中我们只随访到胎儿早期健康情况，对钙离子载体AOA子代安全性仍需要更多的长期随访研究。目前钙离子载体AOA的安全性还存在争议，相关的临床研究证据也比较少，所以在临床应用前必须充分与患者沟通，保证在患者充分知情同意后方可进行。

综上所述，本研究认为钙离子载体AOA可以有效提高严重少弱精子症、手术取精、既往ICSI未受精和受精低下患者的受精率，改善前次因精子因素不育患者的卵裂率。在没有更理想的卵母细胞激活障碍治疗手段之前，钙离子载体AOA仍将是治疗严重少弱精子症、手术取精、既往ICSI未受精或受精低下患者的有效方法之一。