王 蔚 杜 渊 钟 霞 王洪连 孙长侦 刘增金 王 丽 杨思进

脑出血是临床常见的急性、危重性疾病，在中老年人群中发病率较高，为(12～15)/10万人年，在卒中类疾病中位居第二，该病的临床病死率和致残率亦较高，发病1个月内的病死率高达35%～52%，严重威胁人类健康，对生存质量造成严重影响[1]。课题组在前期的研究中发现，具有活血化瘀、祛痰通络的蛭龙活血通瘀胶囊，能够有效治疗脑出血，促进患者神经功能损伤的恢复，改善脑出血后脑水肿形成，保护脑组织[2，3]，但该药的作用机制尚待进一步阐明。Rho/ROCK信号通路能够介导脑出血后炎症反应，影响血脑屏障通透性，与脑出血后脑水肿密切相关，为脑出血的药物研究提供了新途径。本研究通过观察蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠神经功能评分，以及血肿周围组织ROCK2、RhoA、p-MLC的表达，进一步探索该药防治脑出血的有效作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性健康的SPF级SD大鼠，共96只，体质量(280±20)g，由成都达硕实验动物有限公司提供，实验单位使用许可证号为SYXK(川)2018-065。饲养于西南医科大学实验动物研究中心，环境温度(22±2)℃，湿度30%～40%，普通大鼠饲料喂养，自由摄食及饮水。

1.2 药物及仪器蛭龙活血通瘀胶囊(主要成分：黄芪、水蛭、地龙、大血藤、桂枝等)，规格0.4 g/粒，由西南医科大学附属中医医院制剂室提供，批号：20180216；盐酸法舒地尔注射液：规格2 ml∶30 mg/支，成都菀东药业有限公司，批号：180101；兔抗ROCK2多克隆抗体：abcam；羊抗RhoA多克隆抗体：Novus；小鼠抗p-MLC单克隆抗体：CST；逆转录试剂盒：Thermo scientific；大鼠脑立体定位仪：北京众实迪创科技发展有限责任公司；ATPB457A小动物电子称：深圳安普特电子科技有限公司；BSA224S精密电子天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；Centrifuge 5424 R台式高速冷冻离心机：德国Eppenderf；Thermo 991-80 ℃超低温冰箱：美国赛默飞世尔；IMS-40全自动雪花制冰机：常熟雪珂电器有限责任公司；KJ201-BS型震荡器：江苏康健医疗用品有限公司；DYY-10C电泳仪：北京六一仪器厂；ChemiDoc XRS凝胶成像系统：美国Bio-Rad；NanoDrop 2000超微量分光光度计：Thermo scientific； LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪：瑞士Roche。

1.3 造模及模型评估大鼠称重后以400 mg/kg腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，距尾尖0.5 cm处剪断鼠尾，取血50 μl备用。用脑立体定位仪以大鼠俯卧位固定鼠头，常规备皮及消毒后，沿头皮正中纵向切开约10 mm，用30%双氧水腐蚀骨膜使前囟及冠状缝充分暴露，调节定位仪X、Y轴坐标以定位尾壳核区域，使针尖垂直于矢状缝右侧3.0 mm，前囟前0.2 mm处，用三棱针在针尖下钻开颅骨，以颅骨外板为零点调节定位仪Z轴，进针深度为6.0 mm，以5 μl/min匀速将血缓慢注入，留针约15 min后缓慢退针，用骨蜡将钻孔封闭，术后头皮并常规缝合消毒[4，5]。假手术组大鼠只进针不注血。术后按照“5分制法”对大鼠进行神经功能评分[6]，评分为1～3分则认为造模成功，可纳入实验。

1.4 分组及给药实验大鼠按随机数字表法分为假手术组、脑出血模型组、盐酸法舒地尔组、蛭龙活血通瘀组，各24只，各组又划分为12 h、48 h、3 d、7 d，4个亚组每组6只。蛭龙活血通瘀组灌胃给药每日1.2 g/kg，灌胃体积为3 ml；盐酸法舒地尔组腹腔注射每日12 mg/kg[7]；假手术组和脑出血模型组均给予同蛭龙活血通瘀组等体积的生理盐水灌胃。

1.5 观察指标

1.5.1 神经功能评分采用学术界公认的大鼠卒中后神经功能损害程度评分(Neurological Severity Scores，NSS)[8]对大鼠的神经系统功能进行综合测评。测评的内容包括提尾测试、行走测试、感觉测试、平衡测试、反射及异常活动。该项测试的总分为18分，分值越高说明大鼠的神经功能损害程度越严重，若为0分则说明无神经功能损害。

1.5.2 脑组织ROCK2、p-MLC蛋白表达采用蛋白质印迹(Western blot)法检测脑组织中ROCK2、p-MLC蛋白的表达。大鼠NSS评分后，在规定时点予以深度麻醉，快速取出脑组织，去除软脑膜及表面血液，切取出血侧大脑半球血肿周围脑组织，置于试管中，立即保存至-80 ℃冰箱。取0.1 g脑组织，用1 ml RAPI裂解液研磨粉碎提取蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，取50 μg总蛋白量进行SDS-PAGE电泳，湿法电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，相应一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后，HRP酶联二抗常温孵育1 h，TBST洗涤，化学发光法进行信号检测。

1.5.3 qRT-PCR检测ROCK2、RhoA mRNA水平采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)法检测大鼠脑组织ROCK2、RhoA mRNA水平。大鼠NSS评分结束后，给予深度麻醉，快速取出脑组织，去除软脑膜及表面血液，切取出血侧大脑半球血肿周围脑组织，置于试管中，立即保存至-80 ℃冰箱。用Trizol法提取总RNA，根据ROCK-2、RhoA的cDNA序列，由上海生物工程有限公司合成引物。

ROCK2：

上游5’-AGACAGGGAGGTACGACTTGGAAG-3’

下游5’-ACCACTGGAGCTGCCGTCTC-3’

RhoA：

上游5’-GCTACACCACCAATGCCTTCCC-3’

下游5’-CAGCCCCAGGTTCACAGGTTTAC’

逆转录后按95 ℃ 10 min预变性，40个循环(变性95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)进行Real-time PCR扩增，用荧光定量PCR仪进行常规溶解曲线分析测定Ct值，以2-△△CT的计算值作为相对表达水平[9]。

2 结果

2.1 各组大鼠NSS评分比较假手术组术后12 h时NSS评分稍有升高，之后完全恢复；与假手术组比较，脑出血模型组各时点NSS评分均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，模型组大鼠于术后3 d时NSS评分最高，7 d时有所降低；与模型组比较，蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组各时点NSS评分均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠NSS评分比较 (只，

2.2 各组大鼠ROCK2蛋白相对表达量比较假手术组大鼠各时点脑组织内ROCK2蛋白均无明显改变(P>0.05)；与假手术组相比，脑出血模型组脑组织ROCK2蛋白在各时点表达均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，模型组术后ROCK2蛋白表达12 h至3 d时逐渐升高，至7 d时有所降低；与模型组相比，蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组大鼠脑组织ROCK2蛋白表达在各时点均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠ROCK2蛋白相对表达量比较 (只，

2.3 各组大鼠p-MLC蛋白相对表达量比较假手术组大鼠各时点脑组织内p-MLC蛋白均无明显改变(P>0.05)；与假手术组相比，脑出血模型组大鼠脑组织p-MLC蛋白在各时点表达均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，模型组术后p-MLC蛋白表达12 h至3 d时逐渐升高，至7 d时有所降低；与模型组相比，蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组p-MLC蛋白表达在各时点均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠p-MLC蛋白相对表达量比较 (只，

2.4 各组大鼠ROCK2 mRNA水平比较假手术组大鼠各时点脑组织内ROCK2 mRNA水平均无明显改变(P>0.05)；与假手术组相比，脑出血模型组大鼠脑组织ROCK2 mRNA水平在各时点表达均明显升高(P<0.05)，术后ROCK2 mRNA水平12 h至3 d呈逐渐升高，至7 d时有所降低；与模型组相比，蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组大鼠脑组织ROCK2 mRNA水平在各时点均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠ROCK2 mRNA水平比较 (只，

2.5 各组大鼠RhoA mRNA水平比较假手术组大鼠脑组织内RhoA mRNA水平各时点之间均无明显变化(P>0.05)；与假手术组相比，脑出血模型组大鼠脑组织RhoA mRNA水平在各时点表达均明显升高(P<0.05)，模型组术后RhoA mRNA水平于12 h至3 d呈逐渐升高，至7 d时有所降低；与模型组相比，蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组RhoA mRNA水平在各时点均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠RhoA mRNA水平比较 (只，

3 讨论

近年来在脑出血的药物研究领域，与之相关信号通路的研究越来越受到学术界的关注，并逐渐成为研究的热点。在与脑出血后脑水肿相关的信号通路中，Rho-ROCK信号传导通路具有重要的作用。该通路在中枢神经系统中存在极为普遍，可介导神经细胞的再生、血管通透性、组织生长等多种机体功能[10，11]。ROCK2、RhoA是该信号传导通路上的关键因子。Rho激酶(Rho-associated kinase)，即Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK)包括ROCK1、ROCK2，后者主要分布于大脑皮质、小脑浦肯野细胞、海马神经细胞等部位。Rho GTP酶的相对分子量为20～25 kD，它们在细胞骨架的重组及调控方面具有重要的作用。研究表明，Rho GTP酶目前已发现有5个亚家族，它们分别是Rho亚家族、Rac亚家族、Cdc42亚家族、Rnd亚家族，以及Rho BTB亚家族。共包括20个成员，其中RhoA属于Rho亚家族[12]。当机体发生脑出血等疾病状态时，体内的Rho-ROCK信号传导通路被激活，Rho GTP酶与Rho激酶结合，使钙调蛋白形成增加，Ca离子浓度在细胞内升高，肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase，MLCK)被活化，磷酸化肌球蛋白轻链(Phosphorylated myosin light chain，p-MLC)水平升高，最后导致血脑屏障功能减弱，血管内皮细胞的通透性增加，脑水肿形成[13]。

为了进一步研究蛭龙活血通瘀胶囊防治脑出血的作用机制，我们以Rho/ROCK信号通路为研究出发点，以Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔注射液作为阳性对照，比较各组大鼠神经功能缺损评分，采用Western blot、qRT-PCR技术，观察蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠血肿周围组织ROCK2、RhoA、p-MLC表达的影响。本研究结果显示，脑出血模型组大鼠NSS评分明显高于假手术组(P<0.01)，存在明显神经功能损伤的表现，脑出血后Rho/ROCK信号通路被激活，模型组大鼠血肿周围组织ROCK2、p-MLC蛋白表达在各时点均较假手术组明显升高(P<0.01)，ROCK2、RhoA mRNA水平在各时点均较假手术组明显上升(P<0.05)；而蛭龙活血通瘀组、盐酸法舒地尔组大鼠NSS评分在各时点均较模型组显著降低(P<0.01)，血肿周围组织ROCK2、p-MLC蛋白表达各时点均显著下降(P<0.01)，ROCK2、RhoA mRNA水平各时点均较模型组显著降低(P<0.05)。综上，蛭龙活血通瘀胶囊能够明显改善脑出血大鼠神经功能损伤，起到良好的脑保护作用，这可能与该药抑制Rho/ROCK通路，下调脑内ROCK2、RhoA、p-MLC的表达有关。