李 轩，程 浩，方 乐，郝吉庆

肺癌是世界范围内癌症常见的死亡原因之一，非小细胞肺癌(non small cell lung carcinoma,NSCLC)约占肺癌总数的85%，且表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变占NSCLC患者50%～60%，大部分患者发现时已是晚期，预后较差。目前靶向治疗和放化疗是晚期NSCLC患者的主要治疗手段。然而随着用药时间的延长，大多数接受酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinase inhibitor，TKIS)治疗的患者不可避免地会产生获得性耐药，但其耐药机制及如何有效治疗靶向药物耐药后肺癌也成为国内外研究的热点。导致EGFR-TKIs耐药的机制是多种多样的，目前尚不十分清楚。研究表明自噬可在肺癌细胞中被EGFR-TKI激活，高水平自噬可能与EGFR-TKIs继发性耐药相关。程序性死亡因子配体-1(programmed death ligand 1,PD-L1)是经典的免疫逃逸分子，相关研究表明PD-L1在吉非替尼继发性耐药细胞中表达升高，但其是否参与继发性耐药尚不明确。该研究观察调节自噬对PC9/GR耐药细胞株药物敏感性及对PD-L1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

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细胞培养 人肺腺癌吉非替尼敏感细胞株PC9(EGFR19外显子缺失突变)和人肺腺癌吉非替尼耐药细胞株PC9/GR购自中国科学院上海细胞库,培养基为含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和链霉素的高糖DMEM,置于37 ℃、5% CO培养箱中培养。

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主要试剂和仪器 DMEM(高糖)购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物公司；CCK-8试剂盒购自美国Apexbio公司；RT-qPCR试剂盒及逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；LC3B、PD-L1、p62、Beclin1(一抗)购自美国CST公司；山羊抗兔多抗、山羊抗鼠多抗(二抗)购自北京中杉金桥公司;吉非替尼购自大连美仑生物科技有限公司,按照说明书配置储存浓度为10 mmol/L的溶液,分装后放于-20 ℃冰箱中；氯喹二磷酸盐(chloroquine，CQ)、雷帕霉素(rapamycin，Rap)购自北京索莱宝公司，CQ按说明书配制成储存浓度为100 mmol/L的溶液,Rap分装后按说明书配制成储存浓度为400 μmol/L的溶液，放于-20 ℃冰箱中备用；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)购自美国MCE公司，分装后按说明书配制成储存浓度为20 mmol/L的溶液，放于-20 ℃冰箱中备用。细胞培养箱购自美国SHELDON公司产品；酶标仪购自美国SHELDON公司。

1.2 方法

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RT-qPCR检测自噬水平 应用RT-qPCR法测定PC9组、PC9/GR组细胞中PD-L1、Beclin1表达情况。用TRIzol提取细胞总RNA,用逆转录试剂盒获得产物cDNA,采用SYBR Green荧光定量试剂盒测定PD-L1和Beclin1表达情况,应用RT-qPCR法测定PC9/GR组、2.5 mmol/L 3-MA处理PC9/GR组、5 mmol/L 3-MA处理PC9/GR组、10 mmol/L 3-MA处理PC9/GR组、50 μmol/L CQ处理PC9/GR组、100 nmol/L Rap处理PC9/GR组细胞PD-L1表达，以GAPDH为管家基因,由公式Folds=2计算检测基因的相对表达强度。

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Western blot检测自噬及PD-L1水平 利用Western blot检测PC9组、PC9/GR组、2.5 mmol/L 3-MA处理PC9/GR组、5 mmol/L 3-MA处理PC9/GR组、10 mmol/L 3-MA处理PC9/GR组、50 μmol/L CQ处理PC9/GR组、100 nmol/L Rap处理PC9/GR组细胞中Beclin1(p62)、PD-L1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达情况。加入细胞裂解液RIPA/PMSF(100 ∶1)将细胞重悬,置冰上摇晃裂解30 min,4 ℃、14 000 r/min离心30 min,取上清液,BCA法测定总蛋白浓度,在SDS-PAGE凝胶中电泳,转膜、封闭,切膜，GAPDH、PD-L1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜,将PVDF膜置于含兔抗或鼠抗IgG(1 ∶10 000)二抗的5%脱脂牛奶中，室温摇晃孵育1 h,用ECL化学发光试剂盒进行显影,以GAPDH为内参。

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CCK-8实验测定细胞增殖 收集PC9、PC9/GR细胞，各组细胞稀释为8×10/ml细胞悬液,接种于96孔板中,每孔100 μl,培养24 h后,将含不同浓度的吉非替尼培养基加入PC9及PC9/GR细胞孔中,吉非替尼药物浓度梯度设定:0、0.04、0.2、1、5、25、50、100 μmol/L；收集PC9/GR细胞、1 μmol/L吉非替尼处理PC9/GR组、5 mmol/L 3-MA处理PC9/GR组、50 μmol/L CQ处理PC9/GR组、5 mmol/L 3-MA+1 μmol/L吉非替尼处理PC9/GR组、50 μmol/L CQ+1 μmol/L吉非替尼处理PC9/GR组，培养48 h后每孔加入10 μl含10%CCK-8溶液,孵育2 h后,酶标仪上450 nm处测吸光度(optical density,OD)值。细胞活力值(%)=[(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%,并计算各组的IC50值。每组浓度设5个复孔,独立重复实验3次。

2 结果

2.1 自噬在细胞株PC9和PC9/GR细胞中表达

实时荧光定量PCR检测结果显示:PC9/GR组细胞中自噬相关基因Beclin1表达水平略高于PC9组,但差异无统计学意义(图1A)。Western blot检测结果显示：PC9/GR组细胞中自噬相关蛋白Beclin1与PC9组相比差异无统计学意义，但LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高于PC9组,差异有统计学意义(

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<0.000 1)(图1B、1C)。

图1 RT-qPCR和Western blot检测PC9及PC9/GR基础自噬水平A:PC9组与PC9/GR组细胞中Beclin1 mRNA的表达;B:PC9组与PC9/GR组细胞中Beclin1 及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达;C:B图中蛋白灰度值统计;与PC9组比较:****P<0.000 1

2.2 不同方式处理后耐药细胞PC9/GR增殖活性

CCK-8实验结果显示:吉非替尼对PC9组、PC9/GR组细胞增殖的抑制作用均随着浓度的增加而逐渐增强。PC9/GR组细胞的吉非替尼IC50高于PC9组细胞的吉非替尼IC50，差异有统计学意义(

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<0.05)(图2A、2B)。此外，加入2种不同的自噬抑制剂后，PC9/GR细胞增殖受到抑制，较吉非替尼单药(1 μmol/L)比较差异有统计学意义(

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<0.05)，且3-MA抑制作用更明显，故选择3-MA进行后续实验(图2C、2D)。

图2 CCK-8实验测定不同方式处理后细胞增殖活性A:CCK-8实验检测PC9及PC9/GR细胞的细胞活力;B: PC9及PC9/GR细胞的IC50值;C:利用3-MA抑制自噬对吉非替尼耐药的逆转作用；a组：PC9/GR对照组；b组：3-MA单药组；c组：吉非替尼单药组；d组：3-MA+吉非替尼组；D:利用CQ抑制自噬对吉非替尼耐药的逆转作用；a组：PC9/GR对照组；e组：CQ单药组；c组：吉非替尼单药组；f组：CQ+吉非替尼组；与PC9/GR组比较:####P<0.000 1;与c组比较：***P<0.001，****P<0.000 1

2.3 PD-L1在细胞株PC9 和 PC9/GR细胞中表

达及抑制PC9/GR自噬后PD-L1变化

实时荧光定量PCR结果显示:PC9/GR组细胞中PD-L1表达水平高于PC9组,差异有统计学意义(

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<0.05),见图3A。Western blot检测结果显示：PC9/GR组细胞中PD-L1蛋白表达与PC9组相比差异有统计学意义(

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<0.05)，见图3B、3C。3-MA抑制PC9/GR自噬后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ下降，p62升高，PD-L1蛋白表达下降，差异有统计学意义(

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<0.05)，见图3E、3F，且qPCR结果与Western blot结果相一致。

图3 PD-L1在细胞株PC9 和 PC9 /GR细胞中表达及抑制PC9/GR自噬后PD-L1变化A:PC9组与PC9/GR组细胞中Beclin1 mRNA的表达;B:PC9组与PC9/GR组细胞中PD-L1蛋白表达;C: B图中蛋白灰度值统计; D: PC9/GR组与5 mmol/L 3-MA 处理24 h后PC9/GR组细胞中PD-L1 mRNA的表达；E：PC9/GR组与5 mmol/L 3-MA 处理24 h后PC9/GR组细胞中PD-L1及p62、LC3II/LC3I蛋白表达;F:E图中蛋白灰度值统计；与PC9组比较：***P<0.001；与PC9/GR组比较：#P<0.05，###P<0.001，####P<0.000 1

2.4 不同浓度不同时间3-MA处理PC9/GR后PD-L1表达情况

Western blot检测结果显示：2.5、5、10 mmol/L 3-MA组PD-L1表达较对照组下降，差异有统计学意义(

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<0.05)；2.5 mmol/L 3-MA p62表达较对照组上升，但差异无统计学意义(

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>0.05)，5、10 mmol/L 3-MA组p62表达较对照组升高，差异有统计学意义(

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<0.05)；2.5、5、10 mmol/L 3-MA组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达较对照组下降，差异有统计学意义(

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<0.05)。不同时间3-MA处理PC9/GR结果显示：4、8、24、48 h 3-MA处理后的PC9/GR PD-L1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ较对照组下降，差异有统计学意义(

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<0.05)； 8、24、48 h处理后的细胞P62蛋白较对照组上调，差异有统计学意义(

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<0.05)，且24 h p62蛋白变化最明显；qPCR结果与Western blot结果一致，见图4。

图4 不同浓度不同时间3-MA处理PC9/GR后PD-L1表达情况A:不同时间3-MA处理PC9/GR后PD-L1及p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达情况；B:A图灰度值统计；C: 不同时间3-MA处理PC9/GR后PD-L1 mRNA表达情况；D: 不同浓度3-MA处理PC9/GR后PD-L1及p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达情况；E: D图灰度值统计；F: 不同浓度3-MA处理PC9/GR后PD-L1 mRNA表达情况;a：PC9/GR对照组；b: 2.5 mmol/L 3-MA处理PC9/GR细胞组；c: 5 mmol/L 3-MA处理PC9/GR细胞组；d: 10 mmol/L 3-MA处理PC9/GR细胞组；与Con组比较:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1；与PC9/GR对照组比较：###P<0.001

2.5 CQ、Rap、3-MA处理后PC9/GR自噬水平和PD-L1水平

Western blot检测结果显示：3-MA及CQ处理的PC9/GR的PD-L1较对照组下降，差异有统计学意义(

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<0.05)。Rap处理后的PC9/GR的PD-L1较对照组上升，差异有统计学意义(

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<0.05)。3-MA处理后的PC9/GR的LC3II蛋白表达较对照组下降，p62较对照组上升，自噬流通畅，差异有统计学意义(

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<0.001)。Rap处理后的PC9/GR的LC3Ⅱ蛋白表达较对照组上升，p62较对照组下降，自噬流通畅，差异有统计学意义(

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<0.05)。CQ处理后的PC9/GR的LC3II蛋白表达较对照组上升，但p62较对照组也上升，自噬流不通畅，自噬被抑制，差异有统计学意义(

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<0.05)；qPCR结果与Western blot结果一致，见图5。

图5 不同药物处理后PC9/GR自噬水平和PD-L1水平A: 不同药物处理PC9/GR后PD-L1及p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达情况；B：各蛋白灰度值统计；C：不同药物处理PC9/GR后PD-L1 mRNA表达情况；与Con组比较:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 讨论

自噬是一种自我消化的细胞过程，通过形成双膜囊泡(自噬体)将细胞从细胞质中分离出来，这种双膜囊泡可在短时间内降解包括细胞器和蛋白质在内的细胞内容物，从而使细胞可以在恶劣的条件下(例如压力、缺氧和饥饿)生存。目前，自噬在肿瘤的治疗中起着双重作用，可以增加或降低治疗效果，但是，大多数研究认为自噬可以介导某些肿瘤的耐药性。诱导自噬可以促进抗癌药的耐药性，抑制自噬可以有效逆转肿瘤治疗的耐药性。本研究显示，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在吉非替尼耐药细胞株PC9/GR中上调；Beclin1作为自噬形成的主要因子之一,与自噬相互促进，其无明显变化考虑可能与PC9/GR为PC9敏感株继发耐药细胞有关。CCK-8结果显示，PC9/GR细胞对吉非替尼药物敏感性低于PC9；作为影响自噬过程中两种不同类型的自噬抑制剂，3-MA影响自噬的形成过程，CQ影响自噬溶酶体的降解，3-MA和CQ对细胞増殖的影响不同，但二者均可部分逆转细胞对吉非替尼的耐药，且3-MA抑制作用更明显。因此，体外靶向自噬可能部分逆转EGFR-TKI治疗的耐药性。

PD-L1属于重要的免疫检查点。PD-L1与程序性死亡受体-1(PD-1)结合，PD-L1/PD-1通路下调免疫应答效应T细胞，从而引起免疫抑制。已有研究显示PD-L1高表达与原发性EGFR-TKIs耐药有关，但对继发性耐药尚没有明确报道。目前考虑继发性耐药中PD-L1高表达涉及的可能更是一种适应性免疫抵抗。微管相关蛋白1轻链3(LC3)是目前使用最常见的自噬体标志物，LC3I向LC3II的转化可被认为是自噬发生的重要标志；p62是第一个被发现的选择性自噬受体，其降解是另一个广泛用于监测自噬活性的标志物，p62直接与LC3II结合，并被自噬选择性降解；LC3II与p62变化方向相反时，自噬流通畅，但变化方向一致时，自噬流不通畅，代表自噬抑制，故自噬的检测需结合LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62的结果来观察。 本研究显示，PD-L1在吉非替尼耐药细胞株PC9/GR中表达上调，用3-MA抑制自噬后，LC3II/LC3I下降，p62上升，自噬流通畅，自噬水平下降，PD-L1表达降低，差异有统计学意义。不同浓度3-MA处理PC9/GR时，5 mmol/L 3-MA LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62变化最明显，PD-L1随自噬水平的改变而变化； 5 mmol/L 3-MA处理PC9/GR不同时间时，24 h后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62变化最明显，PD-L1随自噬水平的改变而变化。当用氯喹处理PC9/GR时，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ上升，但p62也上升，自噬流不通畅，代表自噬被抑制，PD-L1表达降低，差异有统计学意义；当用Rap处理PC9/GR时，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ上升，p62下降，自噬被诱导，PD-L1表达增加，差异有统计学意义。进一步说明，当不同药物上调或下调自噬时，PD-L1也会随之增加或减少。

综上所述，体外实验结果提示在吉非替尼耐药细胞中抑制自噬可部分逆转PC9/GR吉非替尼耐药性，提示PD-L1可能受自噬调控，且随自噬水平的变化而改变，PD-L1可能参与体外抑制自噬逆转吉非替尼耐药的过程。但PD-L1如何参与体外抑制自噬逆转吉非替尼耐药的具体机制还需进一步探讨。