俞淑娴，曾普华，郜文辉

（1.湖南中医药大学，长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院，长沙 410006）

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，乙型肝炎病毒（ Hepatitis B Virus，HBV）是原发性肝癌发生发展的重要诱因，近70%肝癌患者由HBV 感染导致[1-4]。但HBV 并不能直接诱导肝癌发生，而乙型肝炎病毒X 蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）能通过基因转录调控和多种信号途径影响肝癌细胞增生和凋亡[5]、抑制损伤DNA 的修复、 影响细胞周期进程并促进肝癌转移浸润和复发，已成为HBV-肝癌发展的重要生物指标[6-8]。因此抑制乙肝病毒的关键致癌基因HBx 的表达就可以有效阻止肝癌的发生。

中医药作为恶性肿瘤综合治疗措施中的一个重要组成部分，在提高机体免疫力、提高生活质量、延长患者生存时间等方面具有优势，在临床治疗肝癌的过程中发挥了积极作用[9-11]。

“益气化瘀解毒”是湖南中医药研究院附属医院应用30 余年的临床效验方。既往临床研究证实该方具有稳定瘤体、改善生活质量、抗复发转移而使患者呈现“带瘤生存”的特点[12]，前期实验提示该方能抑制人肝癌细胞和裸鼠移植瘤的生长[13]，能通过调控肝癌PI3K/AKT/mTOR 等信号通路、细胞自噬等方式影响细胞代谢[14-17]。本研究继以往课题的基础上进一步观察益气化瘀解毒方对HBx 的影响，阐明该方对乙肝病毒诱发的肝癌防治过程中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG 2.2.15 细胞购于广州吉妮欧生物科技有限公司；益气化瘀解毒方，药物组成：白参、黄芪、半枝莲、重楼、醋莪术、甘草，购自湖南中医药大学第一附属医院中药房；二甲双胍、重楼皂苷1（MCE，HY-17471A、HY-N0047）；DMEM- 高 糖、胎牛血清、胰蛋白酶（0.25%）、青霉素-链霉素溶液（美国GIBCO 公司，批号分别为：11965092、A3160802、25200056、15240062）；二甲基亚砜DMS0（细胞培养级）（北京索莱宝公司，批号：D8371）；RIPA 裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为：P0013C）；磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer solution，PBS）、D-Hank's 平衡盐溶液（D-HBSS）（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号分别为：PB180327、PB180321）；细胞增殖/毒性检测试剂盒（CCK-8 试剂盒）（美国APExBIO，批号： K1018）；MFN1、MFN2、OPA1 抗体（英国 Abcam 公司，批号分别为：ab104274、ab50838、ab42364）；BCA 蛋白定量试剂盒（北京拜尔迪生物技术有限公司，批号：DEM109-500T）；HIF-1a、FIS1 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号分别为：20960-1-AP、10956-1-AP）；QuantiFast® SYBR® Green PCR Kit 试剂盒（Qiagen，货号：204054）。

1.2 方法

1.2.1 HepG 2.2.15 细胞培养 HepG2.2.15 细胞接种于完全培养基（90%DMEM+10%FBS+1%双抗）中，置于恒温37 ℃5%CO2无菌培养箱中进行孵育。细胞密度达到80%左右时进行传代，取处于对数生长期的细胞做进一步实验。

1.2.2 药物制备 益气化瘀解毒方中药材，用10 倍纯水浸泡30 min，先煎2 h，药渣再次用8 倍纯水煎2 次，3 次煎煮所得药液5 000 mL，离心去渣（2 500 r/min，5 min），用旋转蒸发仪浓缩至每毫克含1 g 药，共525 mL，冻干粉机制成冻干粉（1 g/mL），4 ℃冰箱保存，用时以培养基稀释至10 mg/mL。重楼皂苷1：取5 mg 重楼皂苷1 溶于1 mLDMSO 中，待完全溶解加入57 mL 完全培养基得到浓度为100 μmol/L 的母液，用时将母液稀释至8 μmol/L；二甲双胍：将260 mg 二甲双胍溶于10 mL水，在涡旋混匀仪上充分混匀溶解，加入30 mL 完全培养基配成浓度为100 mmol/L 的母液，用时将母液配成30 mmol/L。

1.2.3 药物分组 实验分为益气化瘀解毒方组、重楼皂苷1 组、二甲双胍组、益气化瘀解毒方加重楼皂苷1 组、益气化瘀解毒方加二甲双胍组。

1.2.4 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测药物对HepG 2.2.15 细胞中HBx 的表达 不同药物组分别干预HepG 2.2.15 细胞24 h，完全培养基组作为空白对照组培养24 h，用RIPA 裂解液（加入蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min，离心收集上清，即为总蛋白溶液。BCA 试剂盒检测所收集蛋白的浓度。蛋白溶液按4:1 的比例加入5*还原型蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15 min，以每孔50 μg 蛋白上样，经SDSPAGE 凝胶电泳分离蛋白，转移至 PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭 2 h。按抗体说明书加入HIF-1α（1:1 000）、MFN1（1:1 000）、MFN2（1:1 000）、FIS1（1:1 000）、OPA1（1:1 000），4 ℃孵育摇床过夜。加TBST，放在脱色摇床上重复洗3 次膜，每次用时5 min，于二抗室温下培育1 h，再次加TBST 并洗3 次膜，每次5 min。根据ECL 试剂盒说明书进行曝光并观察蛋白的表达情况，用image J 软件对灰度值进行分析。实验重复3 次。

1.2.5 RT-PCR 检测HBx基因表达水平 将HepG 2.2.15细胞接种于6 孔板中，每孔8×105个细胞。不同药物组分别进行干预， 完全培养基组作为空白对照组继续培养24 h，PBS 清洗3 次，用Trizol 试剂盒提取总RNA，各实验组取2 μg 总RNA 进行反转录，再以反转录产物为模板，用荧光定量 PCR 检测各实验组细胞中HBx 基因的表达水平。扩增反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，进行40 个循环。在 T100TM 型荧光定量PCR 仪 （BIO-RAD） 上用 QuantiFast®SYBR®Green PCR Kit 试剂盒（Qiagen，Germany）进行反应。实验独立重复3 次。

表1 基因引物序列

1.2.6 分子对接 于PDB 数据库中下载HBx（5FCG）共晶体，采用Ledock 软件对上述共晶体进行删除多余的水分子、配体、添加氢键等蛋白准备工作；采用ChemDraw.16 软件构建重楼皂苷Ⅰ，并计算出能量最低状态；利用Ledock 软件进行配体处理以及分子对接程序。最终采用Pymol 软件展示出重楼皂苷Ⅰ与上述蛋白的分子对接模拟图示。

1.2.7 统计学方法 应用 GraphPad Prism 7 软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示，比较2 组结果时采用t检验进行统计学分析，比较多组结果时采用ANOVA 检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 不同药物组对HepG 2.2.15 细胞HBx 蛋白的影响 与空白对照组对比， 益气化瘀解毒方组、重楼皂苷I 组、二甲双胍组、益气化瘀解毒方加重楼皂苷I组、益气化瘀解毒方加二甲双胍组均能不同程度的下调HBx 蛋白表达量，差异具有统计学意义（P＜0.01）。（见图1，图2）

图1 各组细胞HBx 蛋白表达电泳

图2 各组细胞HBx 蛋白表达量比较（± s，n =3）

2.2 益气化瘀解毒方对HBx mRNA 的影响 与空白对照组对比， 益气化瘀解毒方组、重楼皂苷I 组、二甲双胍组、益气化瘀解毒方加重楼皂苷I 组、益气化瘀解毒方加二甲双胍组均能明显下调HBx mRNA 表达水平，差距具有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

图3 各组细胞 HBx mRNA 的表达水平（± s，n = 3）

2.3 重楼皂苷I 与HBx 的分子对接 实验证明重楼皂苷I 作为单独的一组仍然能够调控HBx 的表达，为了进一步了解重楼皂苷I 与相关基因的作用方式，我们利用分子对接技术进行可视化分析。结果发现重楼皂苷Ⅰ能够很好的与HBx蛋白表面的活性空腔进行结合，并且能够与8 号组氨酸以及12 号苏氨酸形成氢键相互作用。见图4。

图4 重楼皂苷I 与HBx 分子对接

3 讨论

乙型肝炎病毒x 蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）及其编码蛋白在肝癌转化和恶性转移过程中扮演着关键角色[18]。其核心机制为HBV 感染肝细胞时将HBx 整合入宿主细胞核所导致的肝细胞基因组结构变异，HBx 基因不与双链DNA 直接作用，而是通过调控宿主细胞遗传物质的转录，与蛋白直接作用或诱导蛋白降解，进而影响靶蛋白功能[19]，参与癌基因表达调控及细胞内多种信号途径，在肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成、细胞凋亡、代谢和免疫逃逸等过程中发挥着重要作用[20-23]。

益气化瘀解毒方作为临床治疗肝癌的效验方，全方以“虚”“毒”“瘀”为肝癌的病因病机，以“癌毒致虚”理论作为指导，以“扶正抗癌”为主要治疗理念。中医认为癌乃“因虚致癌”，先有正气不足，而后受外来“邪毒”侵袭，导致毒瘀互结而成，癌变进一步发展使正气更虚， 从而又表现出“因癌致虚”的现象，正气虚、邪毒、血瘀三者始终并存， 互为因果，恶性循环，贯穿于肝癌整个病程[24]。在此基础上确立以“健脾理气，化瘀软坚，清热解毒”为基本治法，灵活运用白参、黄芪、半枝莲、重楼、醋莪术、甘草等将该方拟定为治疗肝癌的基础方。我们前期研究发现该方具有调节免疫、稳定瘤体、下调MVD、VEGF、KDR 表达、抗血管生成等作用[12-17]。为进一步探讨益气化瘀解毒方对乙肝病毒x 蛋白所诱导的肝癌的作用效果，本实验拟以益气化瘀解毒方为实验对象，并以重楼皂苷1、二甲双胍为对照，观察各组对HepG 2.2.15 中HBx 的干预效果，探讨益气化瘀解毒方对乙肝病毒中关键治癌因子的影响。

二甲双胍一直是糖尿病的主要治疗药物，研究表明，二甲双胍在肿瘤的治疗上也有一定作用[25-27]，且治疗作用归因于其调节凋亡、自噬、细胞周期、氧化应激、炎症、代谢稳态和表观遗传调控等上下游分子靶点的能力[28]。二甲双胍作用机制的中心是改变细胞的能量代谢，主要通过抑制肝脏糖异生和反对胰高血糖素的作用来发挥降糖作用[29]。因此本研究将二甲双胍作为对照组。

本研究结果显示，益气化瘀解毒方、重楼皂苷1、二甲双胍对HBx 均有不同程度的抑制作用，且益气化瘀解毒方联合重楼皂苷1 抑制效果更佳，说明益气化瘀解毒方中的活性成分可能是重楼皂苷Ⅰ，其机制可能与抑制乙肝病毒所诱发的肝癌中关键致癌基因HBx的量，从根源上抑制肝癌的发生，从而起到治疗肝癌的作用有关。