申萌萌，周雨玫，吴彦辉，赵秀萍，刘雁峰*

（1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

自噬是缺氧、营养缺乏、饥饿等因素诱导下，真核细胞在精细调控机制下将细胞内不必要的或受损的成分清除，为细胞提供能量和营养的复杂过程[1]。自噬在维持子宫内膜正常生理功能、参与病理疾病方面都有重要作用[2]。研究证实，子宫内膜自噬在胚胎着床过程中必不可少，并与妊娠早期的子宫内膜蜕膜化有关[3]。中医药作为重要的辅助治疗手段能提高反复体外受精—胚胎移植失败患者的子宫内膜容受性，尤其是补肾活血中药[4-5]。二补助育汤[6]是国家名老中医肖承悰教授治疗子宫内膜容受性低的临床经验方，前期研究表明，该方药能纠正反复体外受精—胚胎移植失败患者血栓前状态、增加子宫内膜血供等以改善子宫内膜容受性，从而提高临床妊娠率[7-8]。本实验从自噬角度进一步探讨二补助育汤的作用机制。

1 实验材料

选择SPF 级7 ～8 周龄ICR 雌性小鼠24 只，未交配过，体质量（23±2） g；有生育能力的雄性小鼠，体质量（25±2） g。由北京维通利华实验技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。二补助育方由骨碎补、巴戟天、桑寄生、续断、补骨脂、川牛膝等组成，该方药购置于北京中医药大学第三附属医院颗粒药房（北京康仁堂药业有限公司生产）。将颗粒加入0.5%羧甲基纤维素钠中加热溶解，制备成含生药浓度3 g/mL 的浓缩液，置于4 ℃冰箱保存。补佳乐（戊酸雌二醇）购于北京中医药大学第三附属医院药房，批号H20080108（DELPHARM Lille S.A.S.制药），规格每片1 mg 。用0.5%羧甲基纤维素钠制成浓度为0.03 mg/mL 的溶液。米非司酮购于北京中医药大学第三附属医院药房，批号H10950003，规格每片25 mg，制备成浓度为0.68 mg/mL 的油剂。Anti-Beclin1（3495T；美国CST 公司）；Anti-LC3B（ab48394；英国abcam 公司）；2.5%戊二醛；透射电镜（日本HITACHI H-7650）；垂直电泳槽（美国Bio-Rad 公司）；稳压稳流电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；半干转电转印仪（美国Bio-Rad 公司）。

2 实验方法

2.1 分组 每日16:00 将雌雄小鼠以2:1 合笼，次日早晨发现阴栓记为妊娠第一天（pd1）。妊娠小鼠按照随机数字表分为4 组，空白组、模型组、补佳乐组、二补助育汤组，每组6 只。

2.2 模型建立 pd4 早上9:00 空白组皮下注射麻油0.1 mL，余组注射米非司酮油剂0.1 mL。

2.3 给药方法 pd1 起空白组和模型组每日灌服0.5%羧甲基纤维素钠0.2 mL，余组予相应药物溶液0.2 mL，连续5 d。

2.4 样本采集 pd5 下午脱颈处死各组小鼠，计数胚胎着床数目；每组取2 只小鼠，将子宫组织投入2.5%戊二醛，备透射电镜检测；另4 只小鼠一角子宫组织投入4%多聚甲醛固定，备光镜观察；另一角子宫组织保存于-80 ℃，备WB 检测。

2.5 观察指标 1）胚胎着床位点数：于pd5 下午脱颈处死小鼠，记录各组胚胎平均着床位点数。胚胎平均着床位点数=总胚泡数目/该组妊娠小鼠数目。2）光镜下子宫内膜形态学观察：石蜡包埋小鼠子宫组织，切片（4 μm），分别用二甲苯、梯度乙醇脱蜡、脱水，苏木素染色8 min；经水洗、盐酸乙醇化后用伊红染色1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，置于光镜下观察。3）透射电镜观察子宫内膜细胞中自噬小体表达：0.1 mol/L 磷酸缓冲液共漂洗3 次（每次15 min），放置于新饿酸溶液中进行固定2 h；用0.1 mol/L 磷酸缓冲液进行冲洗3 次，用50%、70%、90%、100%乙醇逐级脱水（每次10 min），使用环氧树脂包埋，然后定位，制成超薄切片，醋酸双氧铀染色；最后置于HITACH H-7650 透射电子显微镜下观察。4）WB 方法检测小鼠子宫内膜组织中LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白的表达：研磨样本组织，提取蛋白，BCA 法测定蛋白定量。配制10% SDSPAGE 分离胶溶液；加入5%浓缩胶。上样，每张胶上加入10 μL 的Marker。半干电转移仪将蛋白质电转移至PVDF 膜上。5% TBS-T 脱脂奶粉封闭，室温振荡60 min。一抗4 ℃封闭过夜，二抗37 ℃震荡60 min。ECL 显影。IPP 软件分析目的条带。

2.6 统计学分析 应用SPSS 20.0进行数据统计分析，均数±标准差（±s）表示计量资料，用ONE-WAY ANOVA 进行组间比较，LSD 法两两比较。正态分布或方差齐性不满足时，用非参数检验。

3 实验结果

3.1 平均着床位点数 模型组平均着床位点数明显低于空白组（P＜0.05）。补佳乐、二补助育汤组平均着床位点数较模型组增高，但无显著差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组小鼠妊娠第5 天平均着床位点数（± s，n = 6）

表1 各组小鼠妊娠第5 天平均着床位点数（± s，n = 6）

注：Kruskal-Wallis H 检验，与空白组比较，# P ＜0.05

组别 平均着床位点数空白组 10.33±1.63模型组 3.83±2.79#补佳乐组 6.67±4.37中药组 5.83±5.08

3.2 光镜下子宫内膜形态 空白组子宫内膜间质疏松，腺体和血管表达丰富。模型组子宫内膜发育不良，间质致密，腺体和血管少。补佳乐组和二补助育汤组子宫内膜间质中腺体和血管较模型组丰富（见图1）。

图1 光镜下子宫内膜形态（×200）

3.3 小鼠子宫内膜细胞中自噬小体的表达 各组小鼠子宫内膜细胞中均可见自噬小体表达。空白组表面蘑菇样凸起的胞饮突表达丰富，细胞内可见少量自噬小体；模型组部分细胞有破坏、坏死，细胞表面绒毛丰富，但胞饮突表达少，细胞内自噬小体较其他组多。补佳乐组和二补助育汤组细胞内自噬小体表达虽多于空白组，但较模型组少（见图2）。

图2 小鼠子宫内膜细胞中自噬小体的表达

3.4 小鼠子宫内膜中LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白的表达 与空白组比较，模型组LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白水平均低于空白组，其中LC3-Ⅱ较空白组有显著差异（P＜0.05）。补佳乐组和二补助育汤组LC3-Ⅱ表达高于模型组，但无显著差异（P＞0.05）。二补助育汤组Beclin-1蛋白水平高于模型组和补佳乐组（P＜0.05）（见图3，表2）。

表2 小鼠子宫内膜中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达（± s，n = 4）

表2 小鼠子宫内膜中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达（± s，n = 4）

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与补佳乐组比较，▲P ＜0.05

组别 LC3-Ⅱ Beclin-1空白组 0.20±0.07 0.31±0.06模型组 0.07±0.05# 0.20±0.07补佳乐组 0.09±0.05 0.20±0.10二补助育汤组 0.17±0.08 0.34±0.08△▲

图3 小鼠子宫内膜中LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白表达

4 讨论

肾藏精，主生殖，胞络者系于肾；胞脉上系于心，胞络胞脉均与胞宫有关，但两者非一脉。肾精心血通过胞络、胞脉下达于胞宫，以维持其行经、种子、育胎的功能。因此，肖承悰教授认为肾虚血瘀、心血不足、胞脉不畅是子宫内膜容受性低的主要病机，故自拟“补肾气、通胞脉”的二补助育汤以治之。全方由骨碎补、巴戟天、桑寄生、续断、补骨脂、川牛膝等组成，方中补骨脂、骨碎补并称“二补”。补骨脂有温补脾肾、固精缩尿之功效；骨碎补具有补肾强骨、活血通络之效，两药合用可补肾助孕、活血通脉，有“补肾、活络”并用的寓意。巴戟天补肾益精，促进肾气化生和肾阳鼓动。桑寄生、续断为肖承悰常用药对，二药合用既可补肝肾又可通经络，使补而不滞，还可固胞安胎。川牛膝活血祛瘀、补肝肾。全方共奏补肾活血通脉之功，促进胞宫胞脉与他脏他经间相互联系，改善子宫内膜微环境，有助于胚胎着床和发育。

自噬是真核生物降解、回收细胞内生物大分子和受损细胞器的过程[9]，维持细胞内环境的稳态，被视为细胞的一种生存防御机制。适度的自噬可维持细胞稳态，异常的自噬则与某些疾病的发生、发展有关。研究证实，生理状态下子宫内膜自噬参与胚胎植入过程，自噬机制异常造成蜕膜化障碍和子宫内膜容受性减低，进而影响胚胎着床[10]。

缺氧、激素等诸多因素诱导后，细胞收到自噬信号，Beclin-1 及其复合物在胞浆内形成碗状双层膜状结构-隔离膜，是自噬早期阶段的标志物之一；隔离膜不断延伸，包裹细胞内受损细胞器、蛋白质等，LC3-Ⅱ附着在形成的球状自噬小体膜上，与自噬小体表达一致，是公认的自噬标记物。本研究中，胚胎着床障碍模型由米非司酮制备，其与孕酮受体竞争性结合，抑制孕酮作用，造成子宫内膜细胞自噬作用增强[11]，细胞中自噬小体表达增多，并有凋亡倾向，该结果与孙敬霞[12]研究结果一致。但模型组LC3-Ⅱ、Beclin-1 表达与自噬小体表达不一致，我们考虑与模型组细胞过度自噬诱发凋亡，出现细胞破坏、死亡有关。补佳乐组和二补助育汤组子宫内膜细胞的自噬作用较模型组减弱，说明补佳乐和二补助育汤能调节子宫内膜自噬，维持细胞稳态，利于胚胎着床。

综上所述，二补助育汤能调节子宫内膜细胞自噬，维持细胞内环境的稳态，有利于胚胎着床。