许明娜，郭亚茹，杨 松，王玉茹，刘桂红，辛 勇

（徐州医科大学 a. 研究生学院；b. 附属医院肿瘤放射治疗科，徐州 221002）

宫颈癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC）是人类目前第四大常见癌症。据估计，2018年全世界共有57万例CESC患者，其中31.1万例患者因CESC死亡［1］。宫颈癌成为继乳腺癌后20～39岁妇女癌症相关死亡的第二大原因［2］。宫颈癌癌前病变和癌性病变的主要原因是感染高危型或致癌型人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）。HPV16和HPV18感染是引起CESC的主要原因［3］。高危型尤其是HPV16，在人类中非常普遍。尽管近几十年来在肿瘤治疗和临床诊断方面取得了一些进展，但复发或晚期CESC患者的临床结果和长期生存仍然令人沮丧。因此，探究CESC进展的分子对于改善CESC的治疗有很大的临床价值。转化生长因子β诱导基因（transforming growth factor-β induced gene，TGFBI）位于5号染色体5q31.1条带，编码的蛋白质分子量为74 681 Da，由683个氨基酸组成［4］。TGFBI在细胞内被翻译成蛋白质后分泌至细胞外基质。因此，TGFBI蛋白是一种细胞外基质，在调节内皮血管的生成方面起重要作用。有研究表明，TGFBI可能通过激活有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路来调节内皮细胞，从而在血管生成中发挥重要作用［5］。TGFBI与整合素和其他细胞外基质相互作用，介导细胞黏附和迁移，在生理和病理条件下均发挥重要作用，如糖尿病视网膜病变、角膜营养不良和肿瘤发生等［6］。目前尚无文献报道TGFBI在CESC组织中的研究。本文拟分析TGFBI在CESC组织中的表达水平及其与患者预后关系，以期作为CESC早期新的诊断指标及治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 TGFBI在CESC中和正常组织中的表达情况分析

采用Oncomine数据库检索TGFBImRNA在CESC和正常组织中的表达情况。Oncomine数据库（https://www.Oncomine.org）是一个大型癌症综合性在线数据库［7］，主要用以挖掘癌症基因信息。检索条件 ：“Gene：TGFBI”“Threshold By ：P=1e-4 ；Fold Change：2 ；Gene Rank：Top 10%”“Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis”“Cancer Type：Cervical Cancer”及“Data Type：mRNA”。

运用人类蛋白质图谱（the human protein atlas，HPA）数据库（www.proteinatlas.org） 分析TGFBI蛋白在CESC中的表达情况。 HPA是一项使用基于抗体的蛋白质组学系统地探索人类蛋白质组的国际计划［8］。检索步骤：在HPA数据库首页输入基因“TGFBI”，点击“PATHOLOGY”，可见TGFBI蛋白在CESC组织与正常宫颈组织免疫组织化学分析结果。

通过GEPIA数据库分析TGFBI在宫颈癌组织与癌旁组织的表达差异。GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/help.html）是由北京大学开发的一个交互式网络服务器，用于整合和分析癌症表达谱数据［9］。检索条件：输入基因“TGFBI”，点击“Go-PIA”。

1.2 TGFBI表达水平对CESC患者预后的影响分析

利用 Kaplan-Meier Plotter数据库（https://kmplot.com/analysis/）的宫颈鳞癌数据集分析TGFBI表达量与CESC患者预后的关系。利用此数据库对来自多个数据库的54 000个基因对21种癌症类型生存率的影响进行了分析［10］。设定条件 ：1）Cancer：Cervical squamous cell carcinoma （n=304）；2）Gene symbol：TGFBI；3）Survival：Overall survival；4）Split patients by：median，选择Auto select best cutoff，其余选项设为默认。通过GEPIA数据库及Oncolnc数据库（http://www.oncolnc.org/）进一步验证。

1.3 TGFBI在CESC中的表达情况及与病理分级之间的关系分析

采用 LinkedOmics网站分析TGFBI表达水平与CESC临床病理因素的相关性。LinkedOmics网站（http://www.linkedomics.org/login. php）包含来自癌症基因组图谱计划（the cancer genome atlas program，TCGA）项目的32种癌症类型和共计11 158例患者的多组学数据和临床数据［11］。检索步骤：1）选择肿瘤类型为“CESC”；2）选择TCGA-CESC RNAseq数据；3）输入目的基因“TGFBI”；4）选择数据中的联合分析临床数据“TCGA-CESC Clinical”；5）选择“Non-Parametric Test”，点击“SubmitQuery”进行分析。

1.4 TGFBI在CESC组织中启动子甲基化表达水平分析及其与患者临床病理因素的相关性分析

运用Ualcan数据库分析TGFBI在CESC组织中启动子的甲基化水平，并且分析其甲基化水平与CESC患者临床病理因素的相关性。Ualcan数据库（http://ualcan.path.uab.edu）是一个操作简便的交互式门户网站，可用来深入分析TCGA基因表达数据［12］。进入Ualcan数据库，选择TCGA Gene analysis板块，在“Eenter gene sybol(s)”框中输入目的基因“TGFBI”，在“TCGA dataset”选择“cervical squamous cell carcinoma”，点击Explore进入TGFBI分析界面后，点击“Methylation”进行分析。

1.5 TGFBI在CESC组织中细胞免疫浸润情况分析

采用Timer数据库分析TGFBI在CESC组织中细胞免疫浸润情况。Timer数据库（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）是一个系统分析多种癌症与免疫细胞浸润相关的大型综合数据库［13］。检索条件：在“Gene”模块的“Gene Symbol”输入“TGFBI”，“Cancer Types”选择“CESC”，其余选项设为默认。

2 结果与分析

2.1 TGFBI mRNA在宫颈癌组织的表达

Oncomine数据库分析显示，TGFBImRNA在CESC组织与正常宫颈组织中具有差异表达的共有4个子数据集（图1a）：Scotto宫颈癌（图1b）、Pyeon-Multi癌（图1c）、Zhai宫颈癌（图1d、图1e）、Biewanga宫颈癌（图1f），共236个样本。这提示TGFBI在宫颈癌组织中呈高表达水平，差异有统计学意义（P<0.05）。GEPIA数据库显示，与正常宫颈组织（n=13）相比，TGFBImRNA在CESC（n=306）中呈高表达水平，差异具有统计学意义（P<0.05）（图1g）。

图1 TGFBI mRNA在宫颈癌组织及癌旁组织中的表达Fig. 1 Expression of TGFBI mRNA in CESC and adjacent tissues

2.2 TGFBI蛋白质在宫颈癌组织中的表达

在HPA数据库中提取正常宫颈组织和CESC组织中TGFBI蛋白免疫组织化学图像，进一步证实了TGFBI蛋白在CESC组织中相对正常宫颈组织表达水平明显增加（图2）。

图2 TGFBI蛋白在正常宫颈组织与CESC组织中的表达水平（免疫组化染色，HPA数据库）Fig. 2 Expression of TGFBI protein in normal cervical tissue and CESC tissue ( immunohistochemical staining , HPA database)

2.3 TGFBI表达水平与宫颈癌各临床病理特征的关系

TGFBI表达与CESC的组织类型（P=1.248e-03）、种族（P=6.051e-1）、年龄（P=4.990e-02）、肿瘤纯度（P=1.505e-02）、放疗（P=8.395e-01）、T分期（P=3.656e-01）、M分期（P=8.328e-01）、N分期（P=9.348e-01）、淋巴结转移数量（P=9.307e-01）相关。TGFBI在宫颈鳞癌中的表达高于其他类型CESC组织（图3a）。TGFBI在西班牙裔种族患者中的表达高于其他种族（图3b）。随着患者年龄增大，TGFBI表达增高（图3c）。TGFBI表达量与肿瘤纯度呈负相关，肿瘤纯度升高，TFGBI表达降低（图3d）。在放疗患者中TGFBI的表达量较未进行放疗患者的表达较高（图3e）。Tis分期与T4分期的TGFBI表达高于其他分期组（图3f），N1分期的TGFBI表达高于N0分期组（图3g），M1分期的TGFBI表达高于M0分期组（图3h）。在6个淋巴结转移组的TGFBI表达高于其他数量淋巴结转移组（图3i），差异具有统计学意义（P<0.05）。

图3 TGFBI表达水平与CESC临床病理参数的关系（LinkedOmics 数据库）Fig. 3 Relationship between TGFBI expression and clinical pathological parameters of CESC (LinkedOmics database)

2.4 TGFBI的表达与CESC患者预后的关系

通过Kaplan-Meier Plotter数据库对304个样本进行生存预后分析，结果表明，TGFBI高表达组总体生存时间及无病生存时间更短，预后更差，差异有统计学意义（P<0.05）。通过GEPIA及Oncolnc数据库的进一步检验也证实了以上结论（P<0.05）（图4）。

图4 TGFBI 表达水平与CESC患者预后的生存曲线Fig. 4 Relationship between TGFBI expression and prognosis of CESC patients

2.5 TGFBI在宫颈癌中甲基化情况及其与患者临床病理特征的关系

Ualcan数据库分析显示，在CESC组织中TGFBI甲基化水平较宫颈正常组织降低（图5a）（P<0.005）。随着肿瘤期别的增高，TGFBI甲基化水平降低（图5b）（P<0.005）。如图5c所示，TGFBI甲基化水平在Grade 1最低，在Grade 2中高于Grade 1和Grade 3（Grade 1 vs. Grade 2，P=8.216 800e-01；Grade 1 vs. Grade 3，P=5.725 800e-01 ；Grade 2 vs.Grade 3，P=3.317 400e-01）。81～100岁组患者中TGFBI甲基化水平最低，41～60岁组患者TGFBI甲基化水平高于其他年龄段患者，差异具有统计学意义（P<0.005）（图5d）。TGFBI在子宫内膜癌的甲基化水平低于其他类型的宫颈癌组织，差异具有统计学意义（P<0.005）（图5e）。对TGFBI甲基化水平与CESC淋巴结转移的相关性分析显示，TGFBI在N1的甲基化水平低于N0的宫颈癌组织，差异具有统计学意义（P<0.005）（图5f）。African-American中TGFBI甲基化水平低于其他种族，差异具有统计学意义（P<0.005）（图5g）。肥胖及超重人群中甲基化水平显著低于正常体重人群，差异具有统计学意义（P<0.005）（图5h）。

图5 TGFBI甲基化水平与CESC临床病理特征的相关性Fig. 5 Correlation between methylation level of TGFBI and clinicopathological features of CESC

2.6 TGFBI基因与免疫细胞浸润水平的关系

Timer数据库分析结果显示，TGFBI基因在宫颈癌免疫微环境中与肿瘤细胞纯度、B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞的表达负相关，与巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的表达正相关，P值均小于0.050，差异具有统计学意义（图6）。

图6 TGFBI表达水平与免疫细胞浸润水平的相关性Fig. 6 Correlation between expression level of TGFBI and infiltration level of immune cells

3 讨论

全球CESC死亡率高达50%，其中发展中国家死亡率超过85%［14］。虽然近年来CESC的筛查降低了其发病率和死亡率，但年轻妇女的发病率增高仍然是一个公共卫生问题。持续感染HPV是宫颈上皮内瘤变和浸润性宫颈癌发生的主要原因［15］。但是CESC发病机制仍不明确，目前寻找治疗靶点，探讨其病理机制，对CESC患者的诊断和治疗具有很大价值。

TGFBI是一种由肿瘤细胞分泌的TGF-β诱导的细胞外基质蛋白，它可以作为肿瘤启动子或肿瘤抑制因子［16］。例如，TGFBI的旁分泌机制促进间充质干细胞刺激肿瘤生长［17］。而TGFBI缺乏症使小鼠容易发生自发性肿瘤，TGFBI在体内作为肿瘤抑制因子，其缺失与细胞增殖、肿瘤进展和血管生成有关［18］。TGFBI在多种肿瘤中高表达，并且促进肿瘤细胞的生长侵袭和迁移。例如，结直肠癌患者体内TGFBI高表达，影响癌细胞和内皮细胞之间的串扰而促进肿瘤发生和血管生成［19］。此外，TGFBI在结肠癌中的高表达是癌细胞向肝肺转移的标志［20］，可作为结直肠癌早期诊断的生物标志物［21］。TGFBI在肾透明细胞癌中过度表达［22］，在肾透明细胞癌免疫浸润中起着重要作用［23］，可能是一种新的预后生物标志物和免疫治疗靶标。TGFBI在浆液性和子宫内膜样卵巢癌中的表达高于其他亚型，在Ⅲ期和Ⅳ期的表达高于Ⅰ期［24］。TGFBI作为肿瘤微环境分泌体的成分促进了卵巢癌肿瘤细胞的迁移［25］。TGFBI对间皮瘤和乳腺癌细胞的发育具有抑制作用，可能通过抑制细胞增殖、诱导衰老等途径发挥作用［26］。在口腔鳞状细胞癌中，TGFBI的高表达促进口腔鳞状细胞癌的增殖并与患者预后不良相关［27］。TGFBI与胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力有关，可作为胰腺癌导管癌患者预测预后的生物标志物［28］。此外，TGFBI在膀胱癌［29］、胶质瘤［30］、胃癌［31］、食管癌［32］、黑色素瘤［33］中的表达均高于邻近癌旁组织，并且促进肿瘤的迁移和侵袭。然而，关于TGFBI在CESC中的作用罕有报道。本研究通过多数据库对TGFBI在CESC中的表达及其与患者的临床病理参数的关系展开研究，为CESC的诊断和治疗提供新的方向。

TGFBI在CESC组织中高表达并与临床分期呈正相关，且不利于CESC患者的生存。TGFBI表达与CESC患者的组织类型、种族、患者年龄、肿瘤纯度、放疗、T分期、M分期、N分期、淋巴结转移数量相关。通过HPA数据库分析，进一步得出TGFBI蛋白在CESC组织中的表达高于正常宫颈组织。在CESC组织中TGFBI甲基化水平较宫颈正常组织明显降低。TGFBI的表达与CESC肿瘤微环境中的巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的表达呈正相关，与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞的表达呈负相关，提示TGFBI可能通过调节CESC组织中肿瘤微环境中的免疫细胞浸润发挥作用。因此，可以推测TGFBI在CESC的发生过程中激活机体的免疫系统，从而产生某种特定抗肿瘤免疫应答。

综上所述，TGFBI在CESC中呈高表达的状态，且在CESC中的高水平表达与CESC的恶性程度及患者不良预后显著相关，TGFBI在一定程度上表现出促癌基因特性。因此，TGFBI将有可能成为CESC的标志物及潜在治疗靶点。