宋晓晶，熊 枫，贾术永，王广军，王淑友，王瑾玉，张维波

（中国中医科学院针灸研究所，北京 100700）

通常认为，生命物质的传输是由心血管构成的循环系统完成的。心脏的节律性舒缩提供动力，驱动血液在动静脉之间循环流动，动脉与静脉之间的毛细血管将一部分血浆和其中的物质滤出到组织间隙，与组织细胞交换物质后，再通过毛细血管和毛细淋巴管回收到循环系统中［1］。近年的一些研究表明，血液物质进入组织间隙形成的组织液可在间质中流动，实现生命物质和信息的传输，其流动路径称为间质通道，该路线与中医经络循行有一定的吻合［2］。组织液的流动服从达西定律，其流量与压力梯度成正比，与组织的流阻成反比。以往的研究已证明经脉线的皮下组织具有低流阻特性［3］，是小分子物质循经迁移的物理学条件，但造成低流阻特性的微观结构尚不明确［4］。常规形态学观察时，间质中的水会流失，可导致间质结构的“塌陷”，无法真实显示活体组织的微观结构及其中组织液分布的特征［5］。本研究使用活体激光共聚焦成像技术，在体观察大鼠腹内壁中线荧光素钠聚积部位的结构，以了解活体间质通道的微观结构和组织液的分布。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

健康成年SD大鼠5只，平均年龄5～7周，体重280～300 g，雄性，由中国军事医学科学院动物中心提供［许可证：SCXK-（军）2011-004］。本研究的试验方案已通过中国中医科学院针灸研究所动物伦理委员会审查批准，所有大鼠均按试验动物饲养和使用的国际标准对待。

1.1.2 试验仪器

小动物活体激光共聚焦成像系统（ViewnVivoB30，OptiScan公司，澳大利亚），全自动多功能全景组织细胞扫描分析系统（奥林巴斯VS 120，日本），数码相机（Nikon D5000，带105 mm微距镜头，日本），窄带滤色镜（i-boxine，PHDYUV62mm，日本），600EXⅡ-RT闪光灯（Canon，日本）。

1.2 试验方法

1.2.1 荧光素钠注射

用2%的戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射对大鼠进行麻醉，待大鼠充分麻醉后，将其按仰卧位固定在试验台上。将荧光素纳染料（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）用注射用生理盐水配制成10%的溶液，按0.1 mL/kg的剂量对大鼠进行尾静脉注射。

1.2.2 荧光照相法采集腹内壁的直观图像

荧光染料注射2～3 min后，将大鼠仰卧位放置于试验台上，沿大鼠腹部剑突一线做横行切口，并向尾部做U型切口，暴露腹内壁组织，用消毒脱脂棉擦净腹内壁组织表面渗出物。用本实验室创建的荧光照相法拍摄腹内壁的图像，观察腹内壁表面的荧光分布特征。

1.2.3 活体激光共聚焦成像检测方法和图像分析

将活体激光共聚焦成像系统的扫描探头垂直放置在大鼠腹内壁中线表面，根据成像图片质量调试扫描深度和激光功率，观察、采集大鼠腹中线上a、b和c共3点的活体激光共聚焦成像图；并采集腹中线上这3个点水平旁开1 cm处腹壁组织d、e和f这3个点的成像图。此外，以与腹中线b点水平右侧3 mm处为起点，每3 mm为一个间隔，水平向左移动，共采6个点的图像。用激光共聚焦成像系统软件分析图像视野中活体组织的微观结构。

1.2.4 腹内壁组织Masson染色观察

以腹中线上的观察点a为中心切取长约1.0 cm、宽约1.0 cm、厚约0.5 cm的腹壁组织，固定包埋，做成5 μm厚的石蜡切片，做Masson染色，在显微镜下观察腹中线组织与旁开组织的形态结构特征。

2 结果与分析

2.1 大鼠腹内壁表面的荧光素钠分布特征

肉眼可见大鼠腹内壁表面光滑，壁层表面分布着多条小血管，其中一条沿腹中线纵行分布，在此血管两侧有少量的脂肪组织（图1a）。荧光照相结果显示，大鼠尾静脉荧光素钠溶液注射后，在腹内壁表面出现荧光染料聚集分布的高亮条带。其中，以沿腹内壁中线位置出现的条带最明显；此外，在腹内壁中线两侧还各分布有2条较细的亮线（图1b）。

图1 尾静脉注射荧光素钠后大鼠腹内壁组织的荧光照相图Fig. 1 Fluorograph of internal abdominal wall tissue in rats after fluorescein sodium injection through caudal vein

2.2 大鼠腹内壁中线组织的活体激光共聚焦成像特征

在活体共聚焦成像图中，白亮色区反映荧光染料溶液分布或浸染的区域，白色越多、越亮，代表含有荧光素钠的组织液越多；暗色区反映各种实体组织、细胞结构。

在检测深度为3 μm、激光功率为70 μW的条件下可观察到：在成像区域中沿腹内壁中线方向走行的较粗的黑色管状物，对比实体组织，其为沿腹内壁中线上分布的血管；在血管两边分布着大量与腹中线平行、有序排列的线状结构，可能为纤维结缔组织，此区域的背景较亮，表明在这一组织中荧光染料和组织液较多；亮白色均为分布在这些纤维间隙中混有荧光素钠的组织液。此外，还零星出现暗色不规则的类圆形结构，为脂肪细胞（图2a、2c）。综上，在大鼠腹内壁中线上各点组织的共聚焦成像图中（图2），主要为血管和纤维结缔组织。由于活体组织具有弹性和黏性，在腹内壁中线上a、b和c点移动探头，共聚焦成像图中的微观组织结构会出现一定的位移。

2.3 大鼠腹内壁中线旁开组织的活体激光共聚焦成像特征

以相同的检测参数观察到，在大鼠腹内壁中线上各点水平向左侧旁开3 mm处的组织，即图1a中的d、e、f点，其成像视野中出现大片的黑色区域，亮白区域比腹中线组织减少，图像显示主要是平行排列的粗细不等的黑色条带，其应为肌纤维；在肌纤维间隙中分布着白亮细线，为填充在肌间隙的组织液；其表面分布着与肌纤维走行基本垂直的纤维组织（图2 d～2f）。

在腹正中线b点的右侧，水平向左平移探头，可发现图像视野中出现大量纵行排列有序的纤维结构（图3a）；紧接着出现了和图2a中特征一致的结构，即纵行分布的纤维组织和血管，图像中右侧部分的亮白区域应该是组织间隙，其中充满大量含荧光素钠的组织液（图3b、3c）；当探针从正中线上平移到旁开组织，亮白区域消失，组织中组织液含量逐渐减少，出现较粗的排列有序的肌纤维，表面分布有平行排列的纤维结缔组织（图3d～3f）。

图2 大鼠腹内壁中线及其旁开组织的活体激光共聚焦图像（1 000×）Fig. 2 In vivo confocal laser imaging of the midline and side open tissue of internal abdominal wall tissue in rats（1 000×）

图3 大鼠腹内壁中线向左至水平旁开组织的活体激光共聚焦连续观察图像（1 000×）Fig. 3 In vivo confocal laser imaging from the midline to side open tissue of internal abdominal wall tissue in rats（1 000×）

2.4 大鼠腹内壁腹中线组织的形态结构特征

大鼠腹内壁组织Masson染色结果显示：在与腹内壁表面平行的组织切片中可以观察到，腹中线位置为蓝染的沿中线纵行分布的纤维结缔组织，纤维间的间隙较大；腹中线纤维组织两边为大量有序的紧密排列的肌纤维（图4a）。在腹中线结缔组织与旁开的肌组织之间有较大的间隙（图4b），在活体组织中这些间隙里应该填充着组织液。组织切片显示大鼠腹内壁中线与旁开组织的结构特征与活体激光共聚焦成像结果吻合。

图4 大鼠腹内壁中线和旁开组织的Masson染色Fig. 4 The Masson stain of the midline and the lateral opening tissue of internal abdominal wall tissue in rats

3 讨论

活体激光共聚焦成像是在传统的电子内镜基础上整合了共聚焦激光显微镜而成的，可对组织进行一定深度的断层扫描成像，并能排除聚焦平面之外组织的干扰，具有放大 1 000 倍的能力，可以亚微米的高分辨率实时精准捕捉活体组织成像［6］。它可将探头以极低的侵入程度送达任何器官或深层组织进行显微成像研究，从外周组织、内脏器官到中枢，活体共聚焦成像系统可将光线带到其他显微镜无法抵达的区域，能够在活体组织水平提供细胞及亚细胞层面完整的高分辨率实时影像，实现活体状态下实时、动态的组织结构成像、细胞和分子事件的监测追踪等［7］。同时，避免了离体切片染色造成的真实组织结构破坏和物质成分的流失，尤其适用于活体组织空间结构和组织液分布特征的可视化观察显示。目前，此技术已经在组织微区高分辨成像［8］、组织分子和微血管事件追踪［9］、癌细胞转移追踪［10］等方面开展了应用。

本团队在小型猪、大鼠和人体沿中医经脉循行线的位置，检测到了具有低流阻特性的间质通道［11］，并通过注射示踪剂显示了其循行轨迹［12-13］。但由于缺乏可观察活体间质通道微观结构和充填在结构中的组织液的影像学技术，影响了对循经低流阻间质通道的组织结构特征及其生物学功能的进一步探索研究。2018年，美国有研究团队应用活体激光共聚焦内窥镜观察到了人体多个组织的间质结构特征，以及其中充填的液态组织液［5］，为活体间质和组织液的观察研究提供了优势技术支持。近期，本团队引进了小动物活体激光共聚焦成像这一先进技术，应用此技术在体观察了大鼠腹壁中线组织，即传统中医任脉循行部位的微观结构，观察到在大鼠腹壁正中线组织中存在比周围非经组织较大的组织间隙和较多的组织液，认为其是机体的间质通道［14］。为进一步探索富含组织液的间质通道的微观结构特征，本研究又对大鼠腹内壁组织进行了活体微观结构观察。

本团队提出了组织液流场模型［3］，“水指示剂”荧光素钠尾静脉注射后，通过血液循环分布到组织中，成为组织液［15］，按照组织液流场模型可向间隙较多且流阻较低的大间隙汇聚。本研究用荧光照相观察到，大鼠尾静脉注射荧光素钠1～2 min后，荧光素钠可在腹中线聚积，并在腹内壁表面正中呈现宽约2 mm的亮带。使用活体激光共聚焦成像仪对腹内壁中线的荧光亮带进行观察后发现，该亮带主要由大量平行纤维组成，其纤维排列方向基本与亮带即大鼠的身体长轴平行。腹内壁中线的成像背景亮度较高，表明其中荧光素钠含量丰富，即这些纤维组织中组织液含量较高。在腹内壁中线旁开的区域，纤维组织数量减少，而且多数纤维的走行与身体长轴接近垂直，纤维组织的下层为密集排列的肌肉组织。活体共聚焦成像观察到腹内壁中线组织的微观结构特征与组织取材后Masson染色的结果一致，腹内壁中线是与身体长轴走行一致的间隙较大的纤维结缔组织，中线两边为致密的肌肉组织。在这些实体组织的间隙中，应为大量组织液存在和流动的部位。

本研究应用活体激光共聚焦成像技术首次显示了大鼠腹内壁富含组织液的间质通道，其微观结构特征为较多的纤维成分，且纤维排列与身体长轴平行。根据组织液流变学特性，大鼠腹内壁中线长程、平行排列且有间隙的纤维组织这一结构特性有利于机体组织液流动，可构成组织液流动的低流阻优势通道。此前，有学者使用正电子发射断层扫描（positron emission tomography，PET）等技术发现在针刺得气部位存在平行的毛细血管和胶原纤维［16］；还有学者运用计算机数值模拟证实在穴位周围分布的平行纤维结构有利于组织液的流动［17］。此外，有学者已观察到机体存在具有组织液流动的优势界面，这一界面存在于血管外、皮下等组织间隙，具有一定的结构学特征［18］。本研究使用活体可视化技术，在大鼠腹内壁中线任脉间质通道上观察到大量平行纤维结构特征，与上述研究结果相吻合，为组织液向腹中线汇聚并循任脉间质通道流动提供了组织形态学基础，也为进一步认识间质通道的结构和功能提供了新的研究技术和试验证据，推进了中医经络生物学内涵的研究。