张 倩，陈涛琳，余 雳，黄明敏，谭拥军

（湖南大学生物学院，长沙 410082）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，按病理类型可分为浸润性导管癌和非浸润性导管癌。乳腺癌患者的治疗成功率较低，肿瘤复发风险高，因而其预后较差，导致的死亡率也高。许多蛋白质精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferases，PRMTs）的表达水平和酶活性都在乳腺癌的发病过程中起着重要作用，调控着许多与乳腺癌的发生、发展有关的细胞通路。

共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1（coactivator associated arginine methyltransferase 1，CARM1），又称为蛋白质精氨酸甲基转移酶4（protein arginine N-methyltransferase 4，PRMT4），属于蛋白质精氨酸甲基转移酶家族［1］。作为 I型蛋白质精氨酸甲基转移酶，CARM1能够催化蛋白底物上的精氨酸，形成不对称二甲基精氨酸［2］。CARM1可以通过多种机制激活转录，包括组蛋白H3甲基化［3］、辅助活化因子CBP/P300的甲基化［4］、染色质重构蛋白的招募［5］等，是哺乳动物体内不可或缺的一种酶［6］。已有研究显示，CARM1在结直肠癌［7］、肺癌［8］、乳腺癌［9］等多种癌症中异常表达，且与肿瘤发生、发展及不良预后相关［10］。近年来，CARM1在乳腺癌发生发展中的作用被广泛研究。Morettin等［9］发现CARM1可以被蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）磷酸化，作为雌激素受体α（estrogen receptor alpha，ERα）介导的转录激活的共激活因子。此外，Peng等［11］发现CARM1可与ER结合到染色质增强子区域，通过对底物蛋白高度甲基化来调控ER靶基因的转录，并促进乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和肿瘤发生。但CARM1在不同分型乳腺癌进展中的分子机制还尚未完全阐明。

四环素表达调控系统由Gossen等［12-13］建立，由转录调节因子、四环素反应性启动子和四环素类抗生素三部分组成，包括tet-on基因调控系统和tetoff基因调控系统，具有高倍数诱导基因、可调控基因“开/关”等特点，是目前研究较多的基因表达系统之一。已有报道表明，经过不断改进，四环素表达调控系统的应用已不仅仅局限于癌细胞系和转基因动物，还可以应用于原代细胞，其应用范围变得更加广阔［14］。同时，该系统也为基因的表达与调控、基因的生物学作用研究提供了有效的研究方法。

本研究通过四环素操纵子系统构建可诱导表达CARM1的乳腺癌细胞株，为探索CARM1在乳腺癌中的生物学功能以及在乳腺癌发生发展中的相关机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231细胞、HEK293T细胞储存于湖南大学生物学院分子肿瘤学实验室；感受态DH5α、金牌Mix酶购自北京擎科新业生物技术有限公司；慢病毒载体pVSVG、Δ8.91均来自于上海生博医学生物工程科技有限公司；pLVX-TetOne-Puro载体购自优宝生物科技有限公司；AgeI、EcoRI限制性内切酶购自美国Thermo Scientific公司；Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）以及胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自GIBCO公司；嘌呤霉素（puromycin）、多西环素（doxycycline，DOX）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；β-actin、CARM1抗体购自Cell Signaling Technology公司；BeyoClickTMEdU-488细胞增殖检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

MDA-MB-231细胞与HEK293T细胞所用的培养基均为含10% FBS的DMEM完全培养基。细胞培养箱条件设置为37℃、5% CO2浓度、90%相对湿度。当HEK293T细胞密度达到80%进行转染；当MDA-MB-231细胞密度达到70%进行慢病毒感染后获得可由DOX诱导CARM1过表达的MDAMB-231细胞株（即231-pCARM1细胞）。在后续试验中，用含10% FBS的DMEM完全培养基进行培养的细胞为对照组（即CARM1正常表达细胞），用含1 μg/mL DOX、10% FBS的DMEM完全培养基进行培养的细胞为试验组（即CARM1过表达细胞）。

1.2.2 pLVX -TetOne-CARM1-Puro慢病毒载体的构建

以质粒pcDNA3.1-CARM1为模板，使用5′引物（CCGGACCGGTATGGCAGCGGCGGCGGCGGC）和3′引物（CCGGGAATTCCTAGCTCCCGTAGTGCATGGT）通过PCR进行扩增，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定及胶回收，得到CARM1片段，再使用AgeI、EcoRI限制性内切酶酶切CARM1片段，放置于37℃水浴锅反应1 h，金属加热器85℃ 15 min使酶失活，4℃保存。载体使用AgeI、EcoRI限制性内切酶于37℃反应1 h，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定及胶回收，得到酶切后pLVX-TetOne-Puro载体。将酶切后纯化回收的载体和CARM1片段于22℃水浴锅中过夜连接，反应体系为1 μL pLVX-TetOne-Puro、4 μLCARM1片断、1 μL T4 DNA连接酶、2 μL T4 ligase buffer、12 μL ddH2O。取5 μL连接产物加入到50 μL DH5α感受态大肠杆菌中，置于冰上放置30 min，42℃热激45 s，加入300 μL LB培养基，放入摇床，37℃、220 r/min活化细菌1 h，用移液枪吸取适量菌液进行涂板（含有氨苄青霉素的LB固体培养板），在37℃的细菌培养箱中正置30 min后倒置培养12～16 h。

1.2.3 pLVX-TetOne-CARM1-Puro慢病毒载体的鉴定

于LB固体培养板上挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，选取阳性克隆送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序鉴定。

1.2.4 慢病毒的包装和感染

将pLVX-TetOne-CARM1-Puro（12 μg）与慢病毒包装质粒 pVSVG（6 μg）、Δ8.91（9 μg） 共转染HEK293T细胞，48 h后收集慢病毒上清；1 000 r/min离心5 min，取上清，用0.45 μm的过滤头过滤，去除细胞碎片，获得慢病毒溶液，分装于1.5 mL EP管中，-80℃保存。选取生长状态良好的乳腺癌MDAMB-231细胞，待密度至70%左右，将病毒与完全培养基按体积比为1∶1的比例混合均匀，加入培养皿中进行病毒感染；48 h后更换新鲜培养基，同时加入嘌呤霉素（1 μg/mL）进行筛选，持续7 d，将筛选得到的细胞进行扩大培养，得到受四环素诱导过表达CARM1的乳腺癌MDA-MB-231细胞株。

1.2.5 蛋白提取与蛋白质免疫印迹（Western blot）

细胞用预冷的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗3次，蛋白酶抑制剂与细胞裂解液按体积比为1∶100的比例加入培养皿；轻微摇晃均匀，冰上放置20 min，收集至1.5 mL EP管中，4℃下13 000 r/min离心10 min，收集上清，即为总蛋白。二喹啉甲酸试验法（bicinchoninic acid assay，BCA）测定蛋白浓度。每孔上样量为40 μg总蛋白质，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）；转印至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜；以含有Tween20的Tris缓冲盐溶液（Tris-buffered saline and Tween 20，TBST）配制5%的脱脂牛奶封闭液进行封闭，室温封闭1 h；4℃孵育一抗2 h，TBST洗5次，每次5 min；4℃孵育二抗2 h，TBST洗5次，每次5 min；显影。

1.2.6 RNA提取与实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）

细胞用预冷的PBS洗3次，加入Triton裂解细胞，提取细胞中的总RNA。每个样品取1 μg RNA进行逆转录反应以获得细胞基因组cDNA。以cDNA为模板，加入DNA合成原料和引物进行RT-PCR。分别对CARM1cDNA以及3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）的cDNA（内参）进行扩增，通过检测不同反应体系中CARM1cDNA的荧光强度与GAPDHcDNA 的荧光强度的比值以计算不同样品中CARM1mRNA的相对含量。试验中使用的引物对如下：

CARM1-F：GCCATCCTGCAAAACCACA；

CARM1-R：CGGCAAAAAACGACAGGATC。

GAPDH-F：CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA；

GAPDH-R：GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC。

RT-PCR所使用的程序如下。1）预热：95℃2 min；2）变性：95℃ 15 s；3）退火：55℃ 15 s；4）延伸 ：68℃ 20 s；5）重复步骤2～4，循环40次。

1.2.7 细胞增殖检测

待细胞密度至90%以上，加入1 mL 20 μmol/L胸腺嘧啶脱氧核苷类似物（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）溶液孵育2 h；去除培养基，加入1 mL 4%多聚甲醛固定15 min；去除多聚甲醛，加入1 mL PBS洗3 min，重复3遍；去除PBS，加入1 mL含0.3% Triton-100的PBS，孵育15 min；再加入1 mL PBS洗3 min，重复3遍；去除PBS，加入0.5 mL Click反应液，避光孵育30 min；加入1 mL PBS洗3 min，重复3遍；加入含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidi-no-2-phenylindole，DAPI）的抗荧光淬灭封片液，室温避光孵育15 min。置于荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.8 细胞周期检测

待细胞长满后，用PBS洗3遍，再用0.25%的胰酶消化，收集细胞于1.5 mL EP管中，4℃下1 000 r/min离心5 min；再用 PBS洗3遍，4℃下1 000 r/min离心5 min，去上清，加入500 μL 70%乙醇，吹打均匀，-20℃放置过夜；4℃下1 000 r/min离心5 min，去上清，加入适量PBS，进行碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色，PI与PBS体积比为1∶100，室温避光孵育30 min；将细胞用300目筛网过滤至1.5 mL EP管内，上机检测，所得数据使用软件Flowjo V10进行分析。

1.2.9 细胞划痕试验

将细胞接种于6孔细胞培养板中，确保细胞密度在60%以上；待细胞长满后，去除培养基，用200 μL无菌枪头划3条平行的划痕，用PBS洗2遍。对照组加入2 mL新鲜培养基，试验组加入2 mL含1 μg/mL DOX的培养基进行培养，每隔24 h进行拍照。

1.2.10 平板克隆试验

将细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔细胞数为400个左右，加入1 mL新鲜培养基，待细胞完全贴壁后更换为2 mL新鲜培养基，之后观察细胞状态，每2 d更换1次培养基；14 d后吸去培养基，PBS洗3遍，每孔加入1 mL 0.1%结晶紫溶液染色30 min，再用PBS洗5遍。

1.2.11 UALCAN在线网站分析

UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）是一个TCGA数据库在线分析网站，简单易操作。点击TCGA Analysis，输入目的基因CARM1（PRMT4），选择不同类型的癌症进行相关分析。

2 结果与分析

2.1 在线网站分析CARM1与癌症的相关性

利用UALCAN网站分析了CARM1与不同类型的癌症之间的相关性，发现在结直肠癌（n=327）、肺癌（n=574）、乳腺癌（n=1 211）等癌症中均存在CARM1表达异常（图1）。这与之前的研究也是相一致的［7-9］，进一步表明了CARM1与癌症之间的强相关性。

图1 在线网站分析CARM1与各种癌症的相关性Fig. 1 Analysis of the correlation between CARM1 and various cancers via an online website

2.2 pLVX-TetOne-CARM1-Puro质粒构建及病毒包装

为了探索CARM1在癌症中的生物学效应，我们制备了pLVX-TetOne-CARM1-Puro慢病毒质粒。首先，通过PCR扩增得到CARM1片段，条带长度预计为1 800 bp左右。从图2a中可以看到其条带位置正确。用AgeI、EcoRI限制性内切酶双酶切载体（图2b），之后进行连接过夜、转化、挑取单克隆进行菌落PCR鉴定（图2c）。质粒图谱如图2d所示。选取状态良好的HEK293T细胞，待细胞密度至70%～80%时进行转染，48 h后收取病毒上清，离心后过滤，-80℃下分装保存。

图2 pLVX-Tetone-CARM1-Puro质粒构建Fig. 2 pLVX-Tetone-CARM1-Puro plasmid construction

2.3 诱导过表达CARM1乳腺癌MDA-MB-231细胞株的构建及鉴定

为了验证CARM1对乳腺癌的发生、发展起着什么样的作用，本文检验了乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中CARM1的表达量。结果如图3a所示，MDA-MB-231细胞中CARM1的表达量远远低于MCF-7细胞，因此，我们选择MDAMB-231细胞作为细胞模型。通过病毒感染、嘌呤霉素（1 μg/mL）筛选获得四环素诱导过表达CARM1乳腺癌MDA-MB-231细胞株（图3b）。提取蛋白和RNA进行Western blot检测和RT-PCR分析，结果如图3c和3d所示。与对照组相比，试验组CARM1的表达量在蛋白水平和RNA水平都有明显上升，说明诱导过表达CARM1的乳腺癌MDA-MB-231细胞株构建成功。

图3 诱导表达CARM1乳腺癌MDA-MB-231细胞的验证Fig. 3 Verification of induced expression of CARM1 in MDA-MB-231 cell

2.4 CARM1对乳腺癌MDA-MB-231细胞的生物学作用

在细胞铺满整个培养皿时进行细胞划痕试验，在0、24 h拍照记录。结果发现：与未诱导的细胞相比较（图4a1、4a2），加入DOX诱导24 h后的231-pCARM1细胞（图4a3、4a4）迁移能力更强；使用结晶紫染色来观察细胞克隆形成，发现与未诱导的细胞相比较，加入DOX诱导的细胞克隆形成能力更强（图4b）；使用EdU-488细胞增殖试剂盒检测细胞增殖，发现与未诱导的细胞相比较，诱导后的细胞增殖能力更强（图4c）；利用流式细胞仪检测细胞周期变化，发现与未诱导的细胞相比较，诱导后的细胞G1期细胞比率减少，S期和G2/M期的细胞比率增加，过表达CARM1能够促进细胞周期的进程（图4d）。这些结果表明，诱导过表达CARM1对乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、克隆形成、迁移有一定的促进作用。

图4 过表达CARM1促进了乳腺癌的迁移、克隆形成以及增殖Fig. 4 Overexpression of CARM1 promotes migration, clonal formation and proliferation of breast cancer

3 讨论

乳腺癌是一种高度异质性的疾病，70%～80%未发生转移的早期乳腺癌患者能够得到治愈，而临床上对于绝大多数已发生转移的晚期乳腺癌患者则缺乏有效的治疗手段［15］。2018全球癌症报告显示，乳腺癌在全球女性癌症中的发病率和死亡率位居首位，且发病率仍在上升［16］。

PRMTs涉及许多细胞过程，包括转录、DNA修复、RNA代谢、信号转导、蛋白质-蛋白质相互作用等［17］。CARM1催化精氨酸的甲基化修饰是一种翻译后修饰，不论是在正常生理过程还是疾病中都发挥着不可忽视的作用。Shishkova等［6］发现了130多个CARM1的甲基化底物蛋白，且大多与癌症相关。例如，中介体复合物亚基12（mediator complex subunit 12，MED12）在人类各种癌症中频繁发生突变，与转录调节相关，而CARM1可甲基化MED12，并与其表达呈现正相关性，二者高表达能够显著提高乳腺癌患者的总生存率和无病生存率［18］。另有研究证实，CARM1也可以甲基化组蛋白H3第17位的精氨酸，上调转录因子E2F1（E2F transcription factor 1，E2F1）的表达，进而促进肿瘤的生长与增殖［19］。与此一致的是CARM1过表达增加了细胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）的表达水平，促进了肿瘤的发生［20］。这些证据表明，CARM1的表达水平过高能够促进肿瘤的发生与发展。

以上试验结果表明，CARM1在乳腺癌细胞的增殖、迁移等过程中发挥着相当重要的作用，并可能借此参与乳腺癌的发生、发展以及转移。然而，细胞水平的研究可能无法准确反映在人体内CARM1与乳腺癌之间的联系。因此，在后续的研究过程中，本课题组将在个体水平上更深入地研究CARM1与乳腺癌发病机制之间的联系，以期为乳腺癌的临床干预提供新的治疗靶点。