李麟洲，张桢炎，刘建卓，冯建成，张容鹄，谷风林，吴桂苹

（1.海南大学化学工程与技术学院，海南海口 570228）（2.海南海垦胡椒产业股份有限公司，海南海口 571126）（3.海南大学理学院，海南海口 570228）（4.海南省农业科学院农产品加工设计研究所，海南海口 571100）（5.海南省热带果蔬冷链研究重点实验室，海南海口 571100）（6.中国热带农业科学院香料饮料研究所，海南万宁 571533）

胡椒（Piper nigrumL.）又名白川、王椒，是胡椒科（Piperaceae）、胡椒属（Piper）常绿藤本植物。原产于印度，后传入我国，是我国重要的经济作物。其气味独特，口感辛辣，深受世界各地人民的喜爱，被誉为“香料之王”[1-3]。胡椒梗是胡椒初加工过程中产生的废弃物，在传统加工过后被直接丢弃或被焚烧，带来了环境污染和资源浪费。

精油又称挥发油或香精油，是一类存在于植物的花、叶、枝、根、树皮、果实、种子等部位，可以以蒸馏、压榨、萃取等方式提炼出来的具有挥发性的芳香物质[4-6]。胡椒粒中胡椒精油含量约1%～3%，主要成分是萜烯类物质[7]。胡椒精油具有胡椒的辛辣气味，风味独特，自然醇香[8,9]。目前，胡椒精油一般作为保健用品，供熏香、按摩时使用，有较高的产品附加值。长期以来，国际胡椒市场存在着供不应求的问题[10]，若能够从胡椒初加工废弃物-胡椒梗中提取精油来代替胡椒果精油，或许可以减少胡椒果精油的需求[7]。

精油常用的提取方法有水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法、超临界萃取法等方法[11]。水蒸气蒸馏法工艺简单，设备低廉易得，但精油产率较低[12,13]；溶剂萃取法工艺简单且提取率高，但有机溶剂对环境危害较大，且溶剂残留会对精油品质造成较大影响[14]。超临界萃取法提取效率高，且安全无残留，但生产成本较高，不适合大规模生产[15,16]。国内外利用互补技术提取不同天然产物的功能因子，均比传统法得率高、时间短。王颖等[17]利用超声-微波协同技术提取白胡椒精油，得率达3.80%，比单独微波辅助和单独超声辅助得率均有所提高。酶法辅助水蒸气蒸馏法在保留两种方法优势的基础上，通过生物酶专一性降解底物的细胞壁等细胞结构[18,19]，使得在细胞内的有效物质溶出，从而达到提高精油产率的目的[20]。辜雪冬等[21]利用酶法辅助水蒸气蒸馏技术提取柠檬果皮精油，相较单独使用水蒸气蒸馏，提取率有所提高，提取所需时间大大减少。

目前，国内外关于胡椒果的精油提取已有较多报道，但鲜有关于胡椒梗精油提取及其成分分析的报道。本实验以海南文昌胡椒初加工废弃物-胡椒梗为原料，采用响应面法对酶法辅助水蒸气蒸馏法提取胡椒梗精油条件进行优化，并对胡椒梗精油的化学成分进行分析，以期为胡椒梗废弃物的开发利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

胡椒梗来自海南省琼海市东红农场；正己烷为色谱纯，美国SIGMA公司；纤维素酶，酶活30000 U/g，山东隆科特酶制剂有限公司；无水硫酸钠及其他试剂均为国产分析纯。

HF-200A型高速多功能粉碎机，辰禾盛丰工贸有限公司；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；AUY-220型分析天平，岛津制作所；SPH-200B型恒温培养震荡器，上海世平实验设备有限公司；Agilent 7890B-7250气质联用仪，美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胡椒梗精油的提取

将胡椒梗用自来水洗涤，在60 ℃烘箱中充分干燥，粉碎，过60目筛。准确称取100 g胡椒梗粉末，并按液料比5:1（mL/g）加入100 g/L的纤维素酶，在40 ℃，180 r/min振荡处理3.0 h。将酶处理后的样品放入水蒸气蒸馏装置，水蒸气蒸馏6.0 h，回收分离器中的精油，并计算精油得率。

1.2.2 单因素实验

采取1.2.1中的提取方法，保持酶解温度为40 ℃、酶处理时间为3.0 h，液料比为5:1不变，分别考察酶浓度为0、50、100、150、200 g/L时对胡椒梗精油产率的影响；保持酶浓度为100 g/L，酶处理时间为3.0 h，液料比为5:1不变，分别考察酶处理温度为20、30、40、50、60 ℃时对胡椒梗精油产率的影响；保持酶浓度为100 g/L、酶解温度为40 ℃、液料比为5:1不变，分别考察酶处理时间为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h下对胡椒梗精油产率的影响；保持酶浓度为100 g/L，酶解温度为40 ℃、酶处理时间为3.0 h不变，分别考察液料比为2:1、5:1、8:1、11:1、14:1（mL/g）时对胡椒梗精油产率的影响。通过单因素试验考察各因素对胡椒梗精油产率的影响，进而进一步确认响应面实验的实验因素及水平。

1.2.3 响应面实验设计

在单因素实验的基础上，选取酶液浓度（g/L）、酶处理温度（℃）、酶处理时间（h）、液料比（mL/g）为自变量，以胡椒梗精油得率为响应值，设计四因素三水平响应面实验对胡椒梗精油提取工艺进行优化，其因素及水平设计见表1所示。

表1 响应面实验因素和水平Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.2.4 GC-MS色谱条件

精油前处理：将所得胡椒梗精油样品充分静置，加入少量无水硫酸钠干燥，取上层精油样品，用少量正己烷进行稀释待用。

气相色谱条件：进样量0.5 μL，色谱柱Agilent HP-5MS （30 m×250 μm×0.25 μm），升温程序为：初始温度50 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升温至250 ℃，保持时间7 min，后运行温度为280 ℃。

质谱条件：离子源温度200 ℃，四级杆温度150 ℃，扫描范围40～450 u，采集速度5质谱图/s。

1.2.5 数据处理

实验数据用Design-Expert 8.05等软件进行显著性分析，并通过各因素之间的交互影响效果的三维图来分析各因素之间影响效果的显著性，以预测最佳提取条件，通过比较预测值和实际值的差异可以判断模型的准确性。CG-MS结果采用采用Wiley谱库检索、结合人工解谱和查阅相关文献数据进行定性，并采用面积归一化法计算精油各成分的相对含量。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶浓度对胡椒梗精油得率的影响

由图1可知，当酶液浓度低于100 g/L时，随着酶液浓度增大胡椒梗精油产率也不断增加，但继续增大酶液浓度，精油产率反而缓慢下降。其原因在于纤维素酶可以有效破坏胡椒梗细胞的细胞壁，使有效成分更容易溶出，从而增大胡椒梗精油的产率，随着酶液浓度的增加，底物和纤维素酶的作用更加充分，使精油产率随之增加；但酶液浓度过大，精油产率反而略有降低，这可能是由于酶浓度较高时会大大加快细胞壁的分解速率，细胞壁的分解产物会吸附精油中的某些组分，从而导致精油提取率降低[22]，该结果与张雪松[23]的研究一致。此外，更高的酶浓度会增加生产成本，因此，酶液浓度应选择100 g/L左右为宜。

图1 酶浓度对胡椒梗精油得率的影响Fig.1 The effect of enzyme concentration on the yield of pepper stem essential oil

2.1.2 酶处理温度对胡椒梗精油得率的影响

由图2可知，随着酶处理的增大，胡椒梗精油得率呈现先上升后降低的趋势，在40 ℃左右时胡椒梗精油产率最高，进一步增加温度，精油产率大大降低。这是因为当温度较低时，酶活性很低，产率也较低，随着温度增加，酶活增大，精油产率随之增加，但温度或高反而会使酶活降低，从而降低精油产率。这与周亚军等[24]的研究结果基本一致。因此，酶处理温度选择40 ℃左右为宜。

图2 酶处理温度对胡椒梗精油得率的影响Fig.2 Effect of enzyme treatment temperature on the yield of pepper stem essential oil

2.1.3 酶处理时间对胡椒梗精油得率的影响

由图3可知，胡椒梗精油得率随着酶解时间的增大呈先上升后下降的趋势，在酶解时间为3 h时胡椒梗精油得率最高。其原因可能是随着酶解时间的增大，纤维素酶对细胞的破坏程度增加，促进了细胞内活性成分的释放，但由于酶解反应趋于完全，进一步增加酶解时间精油得率不再增加。其结果与Sowbhagya等[25]提取小茴香精油结果相似。因此，酶解时间以3.0 h左右为宜。

图3 酶解时间对胡椒梗精油得率的影响Fig.3 The effect of enzyme treatment time on the yield of pepper stem essential oil

2.1.4 液料比对胡椒梗精油得率的影响

由图4可以看出，随着液料比的增加，胡椒梗精油的产率呈现先上升后下降的趋势，在液料比为5:1（mL/g）时精油得率最高。这是由于液料比过低时，酶液不能充分浸润物料，酶解效率较低，随着液料比增大，胡椒梗精油得率有所增加，但继续增加液料比，会导致物料比率过低，酶液过量，不但增加了生产成本，而且会造成精油的损失[26]；因此，液料比的选择应该在5:1左右。

图4 液料比对胡椒梗精油得率的影响Fig.4 The effect of liquid to material ratio on the yield of pepper stem essential oil

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果

在单因素实验的基础上，利用Design-Expert软件，选取酶液浓度、酶处理温度、酶解时间、液料比四个因素作为自变量，以胡椒梗精油产量为响应值，采用Box-Behnken实验设计原理，设计四因素三水平响应面实验，各组实验结果见表2。

表2 响应面实验结果Table 2 Response surface experiment results

2.2.2 响应面回归模型的建立与分析

通过Design-Expert软件对实验结果进行回归拟合，得到胡椒梗精油得率和四个因素的拟合二次多项式回归方程为：

由表3方差分析结果可知，响应面实验模型显著性p<0.0001，为极显著，表明该模型具有统计学意义，自变量B为极显著，A、D项为一般显著，C项为不显著，二次项BC为显著，A2、B2、C2、D2均为极显著，表明改模型拟合情况良好，结果可靠。四个因素对胡椒梗精油提取率影响显著程度排序为酶处理温度（B）>液料比（D）>酶液浓度（A）>酶处理时间（C）。

表3 响应面实验方差分析Table 3 Response surface test variance analysis

2.2.3 响应面自变量间交互作用分析

利用软件Design-Expert模拟各因素之间交互作用的三维相应面图如图5～图10所示，由图可以看出，因素AB、BC间交互作用曲线比较陡峭，三维效果图中心区域有明显凸起，表明酶液浓度和酶处理温度、酶处理温度和酶处理时间的交互作用对胡椒梗精油得率的影响最为显著，其他因素间的交互作用对最终精油得率的影响较小。

图5 酶浓度和酶处理温度对胡椒梗精油得率交互影响响应面图Fig.5 Response surface plot of the interaction of enzyme concentration and enzyme treatment temperature on the yield of pepper stem essential oil

图6 酶浓度和酶处理时间对胡椒梗精油得率交互影响响应面图Fig.6 Response surface plot of the interaction of enzyme concentration and enzyme treatment time on the yield of pepper stem essential oil

图10 酶处理时间和液料比对胡椒梗精油得率的影响响应面图Fig.10 Response surface plot of the effect of enzyme treatment time and liquid-to-material ratio on the yield of pepper stem essential oil

图7 酶浓度和液料比对胡椒梗精油得率交互影响响应面图Fig.7 Response surface plot of the interaction of enzyme concentration and liquid-to-material ratio on the yield of pepper stem essential oil

图8 酶处理时间和酶处理温度对胡椒梗精油得率交互影响响应面图Fig.8 Response surface plot of the interactive influence of enzyme treatment time and enzyme treatment temperature on the yield of pepper stem essential oil

图9 酶处理温度和液料比对胡椒梗精油得率交互影响响应面图Fig.9 Response surface plot of the interactive influence of enzyme treatment temperature and liquid-to-material ratio on the yield of pepper stem essential oil

2.2.4 最佳工艺的确定及验证

通过响应面回归方程对胡椒梗精油最佳提取工艺条件进行预测，其结果为酶浓度103.25 g/L，酶处理温度41.28 ℃，酶处理时间3.01 h，液料比5.23:1，预测最佳产率1.20%，在相同条件下实际产率为1.21%，实际结果与理论结果相对误差为0.83%，表明实际结果与回归模型吻合良好，实验结果较可靠。在相同条件下使用蒸馏水做空白对照，胡椒梗精油得率为0.80%，酶辅助水蒸气蒸馏精油得率比水蒸气蒸馏提高51.25%。Molica等[27]采用酶法辅助水蒸气蒸馏法提取柑橘皮精油，在相同条件下，纤维素酶预处理后的柑橘皮精油产率约为对照组的两倍；张雪松等[23]通过复合酶法制备桂花精油，在复合酶添加量为50.7 U/g，液料比为20.3:1，温度为46 ℃，水解时间2.7 h，桂花精油得率为2.75%，比未经酶处理时精油得率提高55.37%，与本实验结果相似，表明本实验结果具有较高可靠性。Nurshazana Mohamad等[28]的研究表明，通过酶处理可以有效增加精油分泌腺体的收缩，促进精油的释放，并且通过酶处理可以破坏细胞壁等结构，使细胞质流出，从而增加精油产率。

2.3 胡椒梗精油化学成分GC-MS分析

2.3.1 胡椒梗精油GC-MS测定结果

在所设色谱条件下，胡椒梗精油的GC-MS色谱图见图11。采用面积归一化法计算各组分的相对含量见表4。由图表可知，从胡椒梗精油中分别解析出47种化合物，主要含有单萜、倍半萜、芳烃、醇类化合物、酯类化合物、酮类化合物等。胡椒梗精油含量最高组分依次为柠檬烯（19.4%）、1-石竹烯（11.2%）、β-蒎烯（10.9%）、异桉油烯醇（10.7%）、3-蒈烯（6.31%）等。

表4 胡椒梗精油化学成分Table 4 Chemical composition of pepper stem essential oil

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表5 胡椒梗精油与其他胡椒产品精油成分相对含量对比Table 5 Comparison of the content of pepper stem essential oil and other pepper products essential oil

2.3.2 胡椒梗精油成分比较分析

对所得胡椒梗精油化学成分表进行分类，整理可知：胡椒梗精油包含单萜12种，倍半萜15种，萜醇11种，芳烃1种，脂肪醇1种，酯类化合物4种，酮类化合物3种。胡椒梗精油与其他胡椒产品精油存在相同成分，王花俊等[29]报道的黑胡椒精油含量前10的组分中，柠檬烯、石竹烯、蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯均为二者共同拥有；与房一鸣等[30]所报道的白胡椒精油成分比较，石竹烯、δ-榄香烯、蒎烯、3-蒈烯均为二者大量拥有。这表明胡椒梗精油具与其他胡椒产品精油具有一些相同的特点。

胡椒梗精油中大量存在的组分均有一定的生物活性，如胡椒梗精油中含量最高的物质柠檬烯，具有抗菌、消炎、抗肿瘤等功效[31]；石竹烯则具有较强的抗癌活性，在清除自由基，抗衰老方面也有一定活性[32]；3-蒈烯具有消炎杀菌的功效[33]，在杀虫除病害方面也有应用。这表明胡椒梗精油具有一定的医疗及保健功效，在生物农药制造方面也有广阔应用前景。

胡椒梗精油和黑胡椒精油的共有组分1-石竹烯、(+)-柠檬烯、(-)-β-蒎烯等均为二者大量拥有，且含量较为接近，其中石竹烯是胡椒辛辣刺激风味的主要来源，因此表明胡椒梗精油在具有黑胡椒精油辛辣风味的基础还具有其独特风味，在食品工业及保健行业拥有广泛前景。胡椒梗精油与白胡椒精油共有大量组分为1-石竹烯、δ-榄香烯、(+)-柠檬烯、β-蒎烯、3-蒈烯等，且3-蒈烯含量非常接近，表明胡椒梗精油和白胡椒精油具有较多相同的活性成分，在按摩、熏香产品以及保健功能上胡椒梗精油可以部分替代白胡椒精油，以减少白胡椒精油需求的压力。

3 结论

本文通过单因素试验和响应面分析法确立了一种酶辅助水蒸气蒸馏法提取胡椒梗精油的生产工艺。结果表明：

（1）经响应面分析，胡椒梗精油的最佳提取工艺为酶浓度103.25 g/L，酶处理温度为41.28 ℃，酶处理时间为3.01 h，液料比为5.23:1（mL/g），在此条件下胡椒梗精油的最佳产率为1.21%±0.02%，在该条件下，酶辅助水蒸气蒸馏法胡椒梗精油的产率比水蒸气蒸馏法提高了51.25%。

（2）通过GC-MS分析，胡椒梗精油中共解离出47种化学物质。其组成成分以烯萜类物质为主，含量最高的组分依次为柠檬烯（19.4%）、1-石竹烯（11.2%）、β-蒎烯（10.9%）、异桉油烯醇（10.7%）、3-蒈烯（6.31%）等。

（3）胡椒梗中含量较高的组分均具有一定的生理及保健功效；此外，胡椒梗精油和黑胡椒精油、胡椒叶精油存在较多共有组分，使得其在具有胡椒精油的风味的基础上具有自己的独特风味。

本文的研究结果为胡椒梗废弃物的综合利用提供了思路，同时可以为胡椒梗精油的提取和综合利用提供理论依据。