何洋，周静，陈薇，张迹，沈婷，冯作山，胡卫成*

（1.新疆农业大学,食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）（2.淮阴师范学院,江苏省高校区域现代农业与环境保护协同创新中心，江苏淮安 223300）

小麦种植范围广泛，我国是世界小麦主产国之一，2019年我国小麦产量为1.33×108t。小麦生产加工中的主要副产物，麸皮的出品率一般为小麦的15%～25%，年产量可达2.00×107t左右[1,2]。小麦麸皮含有丰富的脂肪酸、生育酚、膳食纤维以及酚类化合物。目前85%以上的小麦麸皮用作酿造和饲料生产的廉价原料，很少用于深加工，经济价值不高[1,3]。膳食纤维以多糖的形式存在于植物的细胞壁中，小麦麸皮中的多糖主要为阿拉伯木聚糖（Arabinoxylans，AX），约占麸皮组成的20%。

多糖是植物的次生代谢产物，具有很多生物活性，而多糖的生物活性与其单糖组成、糖苷键的连接方式、官能团、分子量、分支度等有关[4-6]。AX是一种半纤维素多聚糖，由阿拉伯糖和木糖组成，是植物细胞壁的主要成分之一，主要存在麦类、谷物及其麸糠中。AX具有诸多生物活性，如润肠通便、降低胆固醇、调节血糖、抗氧化、免疫调节等[7-9]。近年来，通过摄取食物和食物来源的物质来增强免疫力已被广泛研究，AX在机体免疫调节方面已有一些研究报道，不同来源以及不同提取方式获得的AX均具有免疫调节活性。在日本，米糠中提取的AX作为免疫刺激剂已经上市。Zhou等[10]发现口服木聚糖酶和碱液提取的小麦麸皮AX对BALB/c小鼠的先天性免疫和适应性免疫都有调节作用；Cao等[11]报道AX可以通过增加S180肉瘤小鼠的胸腺指数和T、B淋巴细胞的数量来抑制肿瘤的生长；Akhtar等[12]发现碱液提取的AX对患有球虫病的鸡体液免疫功能具有增强作用，显著提高血清中IgS、IgG和IgM抗体水平。

免疫系统是一个由分子、细胞和器官构成的复杂网络，它们相互作用和交流，以防御病原体的入侵，维持机体的稳态[13]。免疫系统的性能对于保护机体免受病原体的侵害至关重要，它在维持健康平衡中发挥着重要的作用[14]。多糖可以直接或间接与免疫系统相互作用，触发多种细胞、分子活动，激活免疫系统，单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞是作出反应的主要靶点[15]。单核细胞从血液迁移到组织中分化成巨噬细胞，巨噬细胞广泛分布于全身，在宿主体内平衡和抵御病原性感染中发挥着重要作用。与传代细胞相比，原代细胞的形态结构和功能活动更接近体内组织，更适用于研究细胞的生长、分化、代谢及其生理、病理变化[16,17]。在外界因素的刺激下，巨噬细胞可以被激活，从而产生各种细胞因子、干扰素和趋化因子，最终刺激宿主的免疫系统[18]。

目前关于小麦麸皮AX的研究大部分都是基于动物实验，基于原代细胞信号转导调节的研究较少。因此，在本研究中，进一步揭示AX的免疫功能及其机制，我们研究了AX对小鼠腹腔巨噬细胞活力、一氧化氮（NO）产生、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和核转录因子（Nfkbia）的mRNA水平的影响，以及对MAPK和Akt信号通路的影响也进行了分析。这些结果将为AX作为免疫调节剂的开发提供理论依据，提高小麦加工副产物的综合利用水平，为小麦麸皮的综合利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿拉伯木聚糖（AX），水提醇沉法提取于“淮麦33号”小麦麸皮，Sevage法除蛋白，经DEAE 52和Sephadex-G100色谱柱分离纯化，透析除去单糖后冻干。RPMI1640培养基，美国Gibco公司；台盼蓝、脂多糖（LPS）、甲氮甲唑蓝（MTT）、对氨基苯磺酰胺、亚硝酸钠（NaNO2）、N-1-萘乙胺盐酸盐，美国Sigma公司；PVDF膜（0.2 μm），美国Bio-Rad公司；抗体p-Akt、p-ERK、p-JNK、p-p38、Akt、ERK、JNK、p38，美国CST公司；山羊抗兔IgG（HRP）、山羊抗鼠IgG（HRP），美国Abcam公司；反转录试剂盒，美国Thermo公司；Trizol试剂，美国Ambion公司；30% Acr-Bis（29:1）、2×Taq Mastermix、β-actin抗体、化学发光检测试剂盒，北京cwbio公司；异丙醇、甲醇、十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷、甲醛、氯化钠、三氯甲烷、乙醇等，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HERA cell 150i型CO2细胞培养箱、MSC 1.2型超净工作台，美国Thermo公司；JY88-IIN型细胞超声破碎仪，宁波新芝生物科技公司；Mix Mate混匀仪、5415R型小型高速离心机、5810R型台式离心机，德国Eppendorf公司；Infinite 200 pro型酶标仪，瑞士Tecan公司；GEL-DOC-XR型凝胶成像系统、T100型PCR仪，美国BIO-RAD公司；FE20型pH计，上海Mettler Toledo公司；AE31型倒置生物显微镜，厦门Motic公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞的培养

小鼠腹腔巨噬细胞分离于SPF级ICR小鼠腹腔[16]，生长于含有10%胎牛血清、1%（V/V）青霉素和链霉素的RPMI medium 1640培养基中，培养在37 ℃，湿润的含有5% CO2的培养箱中。

1.3.2 MTT法检测细胞活力

参考Hu[19]的方法，细胞计数后，用培养基将细胞稀释为1×107cells/mL，移液枪吸取100 μL种入96孔板，每组设三个复孔，培养过夜后，加入AX，使其终浓度为0、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL，放入培养箱内继续培养24 h，去除上清液，用无血清的培养基将MTT母液（5 mg/mL）稀释为0.5 mg/mL的工作液，每孔加入100 μL MTT工作液，并设空白对照组，培养4 h后加100 μL stopping buffer，继续培养16～20 h，酶标仪摇晃30 s混匀后在570 nm测定吸光度。

1.3.3 NO释放量的检测

细胞计数后，用培养基将细胞稀释为1×107cells/mL，移液枪吸取100 μL种入96孔板，每组设三个复孔，放入培养箱中培养24 h，加入终浓度为0、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL的AX，同时设置阳性对照组，加入1 μg/mL的LPS，24 h后测NO释放量。配制浓度0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L的NaNO2制作标准曲线，取100 μL细胞上清液于96孔板中，加入100 μL Griess试剂，室温下反应10 min后于570 nm处测吸光度值。

1.3.4 半定量PCR检测免疫关联基因mRNA的表达

根据MTT和NO的结果，考虑高浓度的AX对细胞增殖有抑制作用，故选择6.25 μg/mL的AX进行后续研究。调整细胞密度为5×106cells/mL，种入培养皿中，用6.25 μg/mL的AX分别处理细胞1、3、6 h，弃去培养基，加入1 mL Trizol于冰上裂解细胞，然后加入100 μL三氯甲烷，振荡、离心后取水层加入等体积异丙醇，混匀后静置，管底出现的胶状沉淀即为RNA，用0.1% DEPC（焦炭酸二乙酯）水配制的75%乙醇清洗RNA，置于通风橱中晾干，加入30 μL DEPC水溶解RNA，保存在-80 ℃冰箱中。

使用反转录试剂盒完成反转录，得到cDNA，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及PCR条件如表1所示。

表1 引物序列及PCR条件Table 1 Primer sequence and conditions for PCR

PCR反应体系如表2所示，配制1%琼脂糖凝胶，每孔加10 μL PCR产物，电泳的条件为90 V，20 min，完成后用凝胶成像系统拍照。

表2 PCR反应体系Table 2 PCR reaction system

1.3.5 Western Blot检测MAPK和Akt通路相关蛋白表达量

参考Zhang[20]的方法，调整细胞密度为5×106个/mL，种入培养皿中，6.25 μg/mL的AX处理细胞1、3、6 h，弃去培养基，加1 mL预冷的PBS，细胞刮收集细胞于1.5 mL离心管，离心去除上清液，沉淀中加入的RIPA细胞裂解液250 μL（含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂各2.5 μL），细胞超声破碎仪冰浴破碎细胞，离心（4 ℃、12000 r/min）10 min收集上清，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，BSA作为标准品，蛋白上样量为30 μg，上样体系为25 μL。10% SDS-PAGE凝胶电泳（120 V，90 min）分离蛋白，湿转法转蛋白至PVDF膜上（100 V，70 min），5% BSA封闭2 h，TTBS清洗三次，一抗孵育过夜，TTBS清洗三次，二抗孵育2 h，清洗三次后加曝光液曝光。

1.4 数据处理

使用SPSS 23.0软件分析数据，Duncan法进行多组样本间差异显著性分析，p<0.05时表示差异显著，使用Origin 2018绘图。

2 结果与讨论

2.1 AX对小鼠腹腔巨噬细胞活力的影响

为了验证AX对小鼠腹腔巨噬细胞活力的影响，用不同浓度的AX处理细胞24 h，实验结果如图1所示，AX浓度为6.25 μg/mL和12.5 μg/mL时细胞的存活率分别为90.42%和89.99%（p>0.05），对巨噬细胞的活力没有显著影响，随着AX浓度逐渐增大，细胞的存活率显著降低（p<0.05）。文献报道AX对巨噬细胞没有显著毒性，本实验中高浓度AX引起了细胞毒性，可能与AX中共价结合的酚酸（主要是阿魏酸）含量较高有关。阿魏酸对细胞没有毒性作用，但会抑制细胞增殖[21,22]。

图1 AX对小鼠腹腔巨噬细胞活力的影响Fig.1 Effect of AX on the activity of mouse peritoneal macrophages

2.2 AX对腹腔巨噬细胞NO释放量的影响

一氧化氮（NO）是一种生物功能分子，参与了很多重要的生物学活动，NO的产生是活化巨噬细胞的杀伤机制。研究证实，从药用植物或食物中分离的多糖可增加巨噬细胞中NO的产生，从而发挥免疫增强作用[23,24]。在本文研究中，如图2所示，用不同浓度的AX（6.25～200 μg/mL）处理小鼠腹腔巨噬细胞24 h后，所有浓度的AX均能显著增加NO的释放（p<0.05），且与阳性对照LPS诱导的细胞产生的NO的含量（50.20 μmol/L）没有显著差异（p>0.05）；当AX浓度为6.25 μg/mL时，NO的释放量为50.25 μmol/L，是空白对照组的16.78倍（p<0.05）。低浓度的NO（10～250 μmol/L）可以刺激细胞分裂，而高浓度的NO（>500 μmol/L），则会抑制细胞分裂[25]，说明AX诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生的NO均对细胞增殖有促进作用。

图2 AX对小鼠腹腔巨噬细胞NO释放量的影响Fig.2 Effect of AX on the release of NO from mouse peritoneal macrophages

NO通过抑制DNA合成，引起氧化损伤，抑制细胞增殖和抗微生物防御作用[26]，在先天免疫系统中起着重要作用。类似的报告显示，米糠阿拉伯木聚糖在RAW264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中均可以诱导NO释放[27]；玉米麸皮酶改性碱提阿拉伯木聚糖（E-AEAX）和碱提阿拉伯木聚糖（AEAX）也均可以促进人U937单核细胞NO释放量的增加[28]。说明AX可能通过NO途径诱导免疫系统应答，从而增强天然免疫，维持机体健康。活化的巨噬细胞可以通过NO杀死肿瘤细胞，iNOS的表达起着关键作用，Zhang等[29]从小麦面粉中用水提取的AX和酶提AX均能通过增加的iNOS水平而不同程度地刺激NO的分泌。因此，推测AX通过激活小鼠腹腔巨噬细胞增加iNOS的表达来增加NO的释放。

2.3 AX对腹腔巨噬细胞免疫关联基因表达的影响

植物多糖可以激活巨噬细胞，活化的巨噬细胞通过分泌炎症因子来调节免疫[15]，如TNF-α、IL-6、IL-1β。Nfkbia是核因子-κB（NF-κB）的抑制因子，可以阻止NF-κB信号通路的激活。细胞因子的分泌是一种细胞反应，其特征是受体和多种信号通路的协调激活。有研究表明，活化的MAPK和Akt信号通路可以通过刺激/抑制炎症因子的产生和基因的表达来调节免疫[26,30,31]。为了探讨AX对小鼠腹腔巨噬细胞免疫关联基因mRNA表达的影响，用6.25 μg/mL的AX处理小鼠腹腔巨噬细胞0、1、3、6 h，半定量PCR检测细胞中1L-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、Nfkbia等基因mRNA的表达。

如图3所示，在正常细胞中，1L-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、Nfkbia等基因的mRNA几乎不表达，而在AX处理之后的表达量显著增加。在其他相关研究中，Diao等[32]发现白芨多糖诱导并提高RAW264.7细胞iNOS、TNF-α和IL-1β的mRNA水平，并增强这些基因的表达。Park[23]发现落葵多糖可以通过上调iNOS mRNA诱导RAW264.7细胞产生NO。目前的研究表明AX显著增加了小鼠腹腔巨噬细胞中1L-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、Nfkbia基因的表达，这些数据说明AX在体外具有较强的免疫调节作用。Srinivasan等[22]从两个不同品种的小米中提取了两种不同的酚酸结合AX（PCA-AXs）：PCA-AX-L和PCA-AX-K，发现高分支度的PCA-AX-L可以上调RAW264.7细胞TNF-α、iNOS和COX-2等基因mRNA的表达，而酚酸含量高的PCA-AX-K呈下调趋势，推测AX发挥不同的免疫调节作用可能与它的结构相关，因此，未来还需要对AX进行详细的结构分析和多靶点的分子机制研究，以确定其免疫调节潜能。

图3 AX对小鼠腹腔巨噬细胞免疫关联基因mRNA表达的影响Fig.3 Effect of AX on mRNA expression of immunoassociated genes in mouse peritoneal macrophages

2.4 AX对小鼠腹腔巨噬细胞MAPK和Akt信号通路的影响

多糖免疫刺激作用的一个重要机制是增强巨噬细胞的功能，细胞因子的分泌也是受多种信号通路和受体的协调激活。丝裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated protein kinases，MAPK）是先天和适应性免疫反应的重要调节因子，细胞外信号调节激酶（ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）是MAPK通路的三个亚家族。ERK、JNK和p38在许多关键的细胞过程中发挥重要作用，调控基因（如TNF-α、IL-6、iNOS）表达[28,33]。蛋白激酶B（Akt）是生存激酶之一，参与调节细胞的生长、代谢和凋亡。有研究表明，Akt可能参与MAPK信号通路的激活[34]。为了检测MAPK和Akt信号通路是否介导了AX处理的小鼠腹腔巨噬细胞的免疫关联基因的表达，用6.25 μg/mL的AX处理细胞0、1、3、6 h，western blot检测ERK1/2、JNK、p38 MAPK、Akt蛋白磷酸化水平的变化。

如图4所示，AX处理后的小鼠腹腔巨噬细胞中ERK1/2、JNK、p38 MAPK、Akt蛋白的磷酸化水平较对照组显著增加，AX处理1 h后，JNK、p38 MAPK的磷酸化水平达到了峰值；AX处理3 h后，Akt的磷酸化水平显著增加；AX处理6 h后，ERK1/2的磷酸化水平显著增加，这些结果表明AX的免疫反应主要是通过激活MAPK和Akt信号通路，这些结论在其他研究中也得到了证明。Ren[35]等发现白沙蒿多糖可以激活MAPK和PI3K/Akt通路，并且提高RAW264.7巨噬细胞ERK1/2、JNK、p38 MAPK、Akt蛋白的磷酸化水平；灵芝多糖[34]、黄芪多糖[36]也被证实能通过MAPK信号通路蛋白磷酸化诱导免疫细胞激活，说明AX可能通过刺激小鼠腹腔巨噬细胞激活MAPK和Akt通路，上调ERK1/2、JNK、p38 MAPK、Akt蛋白的磷酸化水平，发挥免疫调节作用。

图4 AX对小鼠腹腔巨噬细胞MAPK和Akt信号通路的影响Fig.4 Effects of AX on MAPK and Akt signaling pathways in mouse peritoneal macrophages

3 结论

本文以小麦麸皮AX为对象，研究AX对小鼠腹腔巨噬细胞免疫调节功能的影响。研究结果表明，AX可以刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生NO，促进COX-2、iNOS、Nfkbia、1L-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA的表达，其免疫反应可能是通过激活MAPK和Akt信号通路来实现的。因此，小麦麸皮AX可用于增强免疫功能和预防疾病，同时也为小麦麸皮的综合利用提供新思路，需要更多的研究来阐明AX的结构在免疫应答中的作用。