梁婵华，黄妍，莫敏敏,2，陈城宇,3，宋家乐,4*

（1.桂林医学院公共卫生学院，广西桂林 541199）（2.廉江市人民医院营养科，广东廉江 524400）（3.广西医科大学第一附属医院营养科，广西南宁 530000）（4.桂林医学院第二附属医院临床营养科，广西桂林 541199）

作为人体内重要的消化器官，肠道拥有庞大的肠道菌群并集结了人体70%～80%的免疫细胞。因此，肠道也被认为是人体内最重要的内分泌及免疫器官。正常状态下肠道菌群之间相互依存并相互制约，时刻维持着彼此间的动态平衡状态。肠道菌群失衡将导致肠道免疫系统失衡，使得机体免疫系统异常激活，从而导致肠道炎症甚至是全身炎症反应的发生[1-3]。研究提示，结直肠癌有较明确的“炎症-癌症”转化病变，肠道系统慢性炎症与癌症风险的增加密切相关，严重危害人类健康[4]。临床流行病数据显示，炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）患者的结直肠癌发病率远高于正常人群[5]。而在中国，2018年结直肠癌新发病例和死亡病例分别增至52.1万例和24.5万例，结直肠癌在全部恶性肿瘤发病率排名由第3位升至第2位[6]。因此，探索具有安全性和生物活性的抗炎物质已成为结直肠肿瘤及相关疾病的防治研发热点之一。

元宝枫籽油是从无患子目槭树科槭属落叶乔木元宝枫（Acer truncatumBunge）果实中提炼出来的纯天然木本植物油，富含油酸、亚油酸、功能性脂肪酸-神经酸及丰富的脂溶性维生素E[7]。此外，也有研究报道称元宝枫籽油具有抗菌[8]及抗肿瘤作用[9]，能够增强小鼠免疫力[10]，调节肠道菌群[11]，并能够改善力竭运动大鼠氧化应激和体内炎症反应水平的功效[12]。此外，元宝枫油乳液能促进新生组织生长，对体细胞有修复作用[13]，目前，枫籽油已经被国家卫健委批准列为新资源食品。

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，由脂质和多糖构成。研究表明，在实验动物腹腔内暴露低剂量LPS可通过紧密连接选择性地增加肠道通透性，诱发肠道出现炎症反应，从而模拟急性肠道功能障碍[14]。因此，本研究采用腹腔注射LPS的方式来建立小鼠肠道炎症模型。通过观察元宝枫籽油对LPS肠道损伤小鼠体重，肠道炎症水平及结肠组织病理的改善情况；评估对炎性指标物MPO酶活性及氧化应激损伤指标MDA的影响，观察对NLRP3炎症小体相关因子mRNA表达的影响。以此探究元宝枫籽油对肠道炎症反应的改善效果并比较其效果是否与玉米油存在差异，为元宝枫籽油这种新资源食品将来应用于肠道炎症患者的肠内营养治疗提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

元宝枫油（亚油酸≥30.0%，油酸≥15.0%，神经酸≥5.0%）由西安拓丰生物科技有限公司提供（生产年份：2020年3月）；玉米胚芽油（不饱和脂肪酸含量为≥80.0%，亚油酸≥40.0%）由山东西王食品有限公司提供（生产年份：2019年12月）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，L8880）、Trizol法总RNA提取试剂盒（R1200-50T）、TaqMan快速qRT-PCR试剂盒（T2210-200T）：北京索莱宝生物科技有限公司；苏木素-伊红（H&E）染色试剂盒（C0105）：上海碧云天生物技术有限公司；白细胞介素（interleukin, IL）-1β，IL-6，IL-18，肿瘤坏死因子-α（TNF-α），髓过氧化 物 酶（myeloperoxidase，MPO）及 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒，均购于江苏科特生物技术有限公司；普通啮齿类维持饲料（AIN-93M），购自常州鼠一鼠二生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AL204电子分析天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；Eppendorf 5424R冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Quant StudioTM 6 Flex PCR仪，美国Thermo Scientific科技公司；KZ-II高速组织研磨仪，武汉塞维尔生物科技有限公司；ELx808酶标仪，美国BioTek公司；Leica DM4B显微镜，德国徕卡仪器有限公司；L-600离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 实验动物

SPF级健康ICR雄性小鼠（总28只，12周龄，体重34.4±1.1 g），由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号SCXK（湘）2016-0002；所有动物均置于桂林医学院公共卫生学院实验中心SPF级动物房饲养，实验单位许可证号：SYXK（桂）2020-0005。本研究经桂林医学院实验动物伦理委员会审查通过（GLMC201803049）。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物分组与给药处理

所有经小鼠1周适应性喂养后，以每组7只随机分为正常组，损伤组，玉米油组，元宝枫籽油组行后续实验。小鼠肠道损伤模型依赵晓等[15]的方法进行操作，损伤组，玉米油组，元宝枫籽油组小鼠经腹腔注射LPS（3.5 mg/kg）造模，正常组注射等量生理盐水。注射24 h后，分别测量各组小鼠空腹体重，正常组和损伤组灌胃生理盐水（100 μL/d），元宝枫籽油组和玉米油组分别灌胃等量油样至第7天。整个实验期间以普通饲料继续喂养，自由摄食与饮水。

1.4.2 实验动物体重测量、生物样本的收集与处理

在整个实验期间内（共7 d），每日于固定时间点测量小鼠体量、摄食与饮水情况并记录。待7 d干预结束后，各组小鼠12 h禁食（自由饮水），以CO2安乐死法牺牲小鼠。自腹部中央动脉采集血样，以3500 r/min在4 ℃条件下离心15 min后制备血清后留存-80 ℃冰箱备用。取血后，置实验动物于冰上，快速分离其心脏、肝脏、脾脏、肾脏、睾丸及结肠组织，用冰生理盐水洗去表面杂质，滤纸吸干，计算脏器指数[(脏器质量/体质量)×100%]。测量结肠长度后，取部分用生理盐水制成10%的组织匀浆液，700 r/min条件下离心15 min制备上清液留存于-80 ℃冰箱用于后续指标的检测。剩余结肠组织部分用4%多聚甲醛固定待进行病理分析，余下组织则保存于-80 ℃冰箱用于后续qPCR分析。

1.4.3 血清及结肠组织中相关炎症因子水平测定

严格依照ELISA检测试剂盒的相关说明操作，分别检测血清和结肠组织匀浆液中的IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平（单位：ng/L），及结肠组织中的MPO水平（单位：ng/L）与MDA水平（单位：µmol/g protein）。

1.4.4 结肠组织标本处理及病理染色观察

将1.4.2部分中所述经固定后的结肠组织进行常规石蜡包埋、切片后（5 μm），进行H&E染色，用徕卡DM4B光学显微镜观察组织病理学改变，并拍摄图像记录。

1.4.5 qRT-PCR法测定肠黏膜组织中NLRP3炎性小体相关因子mRNA的表达

以细胞刮刀收集适量结肠组织（200 mg）的黏膜并按试剂盒要求提取黏膜中总RNA并检测其纯度。依qPCR试剂盒要求充分混匀各组分，即在总反应体系中加入2 μg的RNA样品，25×qRT-PCR预混液（1 μL），5×qRT-PCR缓冲液（5 μL），目的引物混合物（10 μmol/L，2 μL），TaqMan探针（0.2 μmol/L）并补ddH2O至总体积25 μL后置于QuantStudioTM6 Flex PCR仪中扩增。扩增反应条件为反转录（50 ℃，20 min），变性（95 ℃，3 min），退火（56 ℃，20 s），延伸（72 ℃，30 s）实施30～35个循环反应。每个基因cDNA样本平行扩增3次，取Ct值均数，依据以下公式计算目的基因表达水平。

本研究中Nlrp3、Asc、Il1β、Caspase1引物序列依据课题组先前研究[16]并由Thermo Scientific公司负责合成。

1.5 统计学处理

数据应用SPSS 22.0统计软件分析，实验结果均以均数加减标准差表示，且所有实验均重复3次。数据统计处理使用单因素方差分析（ANOVA）并进行多组之间均数的差异性检验，p<0.05有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 元宝枫籽油干预对LPS处理后小鼠体重的影响

如图1所示，实验开始前各组小鼠体重均无显著性差异（p>0.05）。相比于正常组小鼠体重而言，LPS腹腔注射处理能显著造成小鼠体重下降（p<0.05）。造模后小鼠分别进行灌胃干预，结果显示，各组小鼠体重均呈升高趋势。相较初始体重，正常组小鼠体重增长了4.76%。观察其他另外三组小鼠体重发现，相较初始体重，玉米油组小鼠体重减轻了3.17%，而损伤组小鼠体重减轻了5.20%，但这两组小鼠之间的体重变化无显著性差异（p>0.05）。元宝枫籽油组小鼠体重较初始体重增长了0.17%，其恢复初始体重程度较玉米油组和损伤组大，且具有显著性差异（p<0.05）。

图1 元宝枫籽油对LPS处理后小鼠体重变化的影响Fig.1 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on body weight changes in LPS-treated mice

2.2 元宝枫籽油干预对LPS处理后小鼠脏器指数的影响

如表1，各组之间小鼠的心脏指数及肾脏指数差异都无统计学意义（p>0.05）。而LPS损伤组小鼠的肝脏及脾脏指数较正常组小鼠升高，睾丸指数较正常组小鼠降低，且具有显著性差异（p>0.05），这一结果提示了LPS处理对小鼠的肝脏、脾脏、睾丸具有潜在的毒性作用。而玉米油组和元宝枫籽油组小鼠的肝脏指数及脾脏指数较LPS损伤组小鼠降低，其睾丸指数较LPS损伤组小鼠升高，但无显著性差异（p>0.05）。

表1 元宝枫籽油干预对LPS处理后小鼠脏器指数的影响（%）Table 1 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on organ index in LPS-treated mice

2.3 元宝枫籽油干预对LPS处理后小鼠结肠长度，重量与长度比的影响

结肠的重量、长度是评价肠道炎症疾病所致肠壁增厚程度和炎症强度的重要指标，特别是结肠重量与长度比能有效反映疾病发展的进程[17]。与正常组相比而言，LPS处理能显著造成小鼠结肠长度缩短至11.52 cm（图2，p<0.05）。同时，相比于正常组小鼠，LPS处理还显著造成了结肠重量与长度比的升高至4.91 mg/mm（p<0.05）。而元宝枫籽油干预7 d后肠道损伤小鼠肠长度恢复至11.82 cm，改善了LPS所致肠道炎症模型小鼠结肠缩短的情况。此外，元宝枫籽油还能有效降低模型组小鼠结肠重量（至508.26 mg）和结肠重量与长度比（4.21 mg/mm）（p<0.05）。

图2 元宝枫籽油干预对LPS处理后小鼠结肠长度（a）、结肠重量（b）及结肠重量与长度比（c）的影响Fig.2 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on colon length(a), weight (b) and colon weight to length (c) in LPS-treated mice

2.4 元宝枫籽油干预对LPS处理后小鼠结肠病理改变的影响

通过观察组织切片发现（图3a～d），与正常组相比，LPS诱导损伤组小鼠结肠组织出现肠壁结构破坏，上皮细胞坏死，炎性细胞浸润严重等病理改变。玉米油干预对LPS肠道损伤模型小鼠结肠组织黏膜的毁损，炎性细胞浸润等情况没有得到较好改善。而连续灌胃元宝枫籽油7 d后，小鼠结肠组织上皮结构明显恢复正常，隐窝腺较完整，炎性细胞浸润减少，绒毛清晰。结果表明元宝枫籽油能够改善肠道黏膜屏障功能，促进黏膜修复。

图3 枫籽油干预对LPS处理后小鼠结肠病理改变（a～d）及结肠中MPO与MDA水平（e、f）的影响Fig.3 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on pathological changes, MPO and MDA in colon of LPS-treated mice

2.5 元宝枫籽油干预对LPS处理后小鼠结肠组织中MPO酶活性与MDA水平的影响

MPO是嗜中性多形核白细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）的特异性功能标志并能够反映其活化程度，主要存在于髓系细胞的嗜苯胺蓝颗粒中。MPO的活化状态不仅与急性或慢性炎症状态下组织损伤有关，还参与细胞间信号作用的各种生理过程并能作为判断肠道炎症强度的有效指标[18]。同时，机体组织中过度的炎性反应同时也会引发细胞的氧化应激损伤，引发细胞膜脂质过氧化反应从而造成MDA与氧化/亚硝化应激生物标志物4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）的升高[19]。由图3b可知，腹腔注射LPS处理能显著引发小鼠结肠中MPO酶活性及MDA水平的升高（p<0.05）。相反，元宝枫籽油处理则能显著抑制LPS诱发的炎症小鼠结肠中MPO活性及MDA水平（p<0.05），且相较于LPS损伤组小鼠降低了28.25%和35.10%，而较玉米油组降低了19.63%和30.43%。本研究结果提示元宝枫籽油可能通过调控MPO酶活性，减轻中性粒细胞浸润程度；同时减轻损伤小鼠肠道中过度氧化应激产物MDA的生成，从而逆转LPS所造成的小鼠结肠组织的炎性反应及氧化应激损伤。此外，研究报道神经酸干预能够增强大鼠脑组织中谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）及γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（γ-glutamate cysteine ligase，γ-GCL）活力，升高大脑还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量并降低MDA水平从而改善1-溴丙烷染毒所造成的大鼠认知功能损伤[20]。

2.6 元宝枫籽油干预对LPS处理后小鼠血清中炎性细胞因子水平的影响

在炎症反应的刺激下，机体的免疫系统会发生紊乱，而免疫细胞会过度分泌一系列炎性细胞因子（如IL-1β，IL-6，IL-18，TNF-α）[21]。其中，IL-1β与TNF-α具有协同作用，能共同诱导内皮细胞表达黏附分子，促进白细胞黏附，从而导致肠道组织损伤加重[22,23]。而IL-6和IL-18则是通过加强炎性细胞因子的级联反应，造成炎症介质大量产生，最终引起局部炎症反应[24]。如图4所知，相较于正常组，LPS损伤组的小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平均有显著提高（p<0.05）。而玉米油组小鼠血清中细胞因子水平与LPS损伤组小鼠相比，IL-1β、IL-6、IL-18水平均有下降，TNF-α水平则略有上升，但差异均无统计学意义（p>0.05）。相反，元宝枫籽油组小鼠血清中细胞因子水平与LPS损伤组小鼠相比，IL-1β水平下降27.40%、IL-6水平下降24.80%、IL-18水平下降17.80%、TNF-α水平下降30.50%，且差异均有统计学意义（p<0.05）。元宝枫籽油组小鼠血清中细胞因子含量与玉米油组相比，IL-1β下降22.70%、IL-6下降20.40%、IL-18下降9.90%、TNF-α下降31.80%，且差异均有统计学意义（p<0.05）。结果表明，元宝枫籽油干预能够下调小鼠血清中细胞因子水平，控制肠道组织中炎症反应的进程。此外，李彤与孙红伟的[12]研究结果也提示，元宝枫油可明显降低一次性力竭运动大鼠体内血清中炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的水平。

图4 元宝枫籽油对LPS损伤小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α含量的影响Fig.4 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on serum levels of IL-1β，IL-6，IL-18 and TNF-α in LPS-induced mice

2.7 元宝枫籽油干预对LPS处理后小鼠结肠组织中炎性细胞因子水平的影响

结肠组织中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平的升高是肠道炎症的重要特征之一[25]。由于免疫系统处于紊乱状态，异常激活的TNF-α通过诱导杯状细胞丢失，破坏结肠黏膜结构，减薄结肠黏膜层厚度，促使炎性细胞因子侵袭，进而加速炎症发展[26]。元宝枫籽油含有大量的神经酸，神经酸不仅有助于脑部疾病治疗，还具有增强机体免疫力的作用[27]。王熙才等[10]研究结果也提示，元宝枫籽油处理能够有效促进小鼠体内淋巴细胞增殖，增强小鼠免疫系统。如图5所示，LPS损伤组的小鼠结肠组织中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平相较于正常组均有显著提高（p<0.05）。玉米油组小鼠结肠组织中细胞因子水平与损伤组相比，IL-6与IL-18水平略有下降，而IL-1β、TNF-α水平略有上升，但差异都无统计学意义（p>0.05）；元宝枫籽油组小鼠结肠组织中细胞因子水平与LPS损伤组相比，IL-1β下降14.50%、IL-6下降23.10%、IL-18下降27.40%、TNF-α下降20.90%，且差异具有统计学意义（p<0.05）。元宝枫籽油组小鼠结肠组织中细胞因子水平与较玉米油组相比，IL-1β下降12.80%、IL-6下降18.30%、IL-18下降19.80%、TNF-α下降20.30%，且差异具有统计学意义（p<0.05）。结果提示元宝枫籽油可能通过纠正肠道免疫系统，抑制免疫细胞异常分泌炎性细胞因子，进而改善肠道炎症疾病。

图5 元宝枫籽油对LPS损伤小鼠结肠组织中的IL-1β，IL-6，IL-18和TNF-α含量的影响Fig.5 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on the colon levels of IL-1β、IL-6、IL-18 and TNF-α in LPS-induced mice

2.8 元宝枫籽油干预对LPS处理后小鼠结肠组织中Nlrp3，Asc，Caspase1和Il1β的mRNA转录影响

亚油酸是一种重要的功能性多不饱和脂肪酸，具有降血脂，抗癌，预防动脉有样硬化等生理功能，同时还参与机体免疫调节[28]。有研究认为亚油酸对炎症反应具有积极作用，能够抑制IL-1β、IL-6、TNF-α和caspase-1等相关因子的表达，促进伤口愈合，缓解炎症水平[29,30]。但是，亚油酸的氧化产物能增加炎症介质生成，改变免疫细胞功能，从而加速诱导炎症反应的发生[31,32]。乔谦等[7]调查了我国天然分布区内14个种源的元宝枫籽油后发现，元宝枫籽油中富含约91.47%的不饱和脂肪酸[其中，亚油酸（32.97%）、油酸（25.19%）、神经酸（5.76%）、亚麻酸（2.76%）]及丰富的维生素E，具有良好的抗氧化作用。而玉米油则是以ω-6脂肪酸亚油酸为主的一类食用植物油，亚油酸含量高达51.7%[33]。如图6示，LPS处理显著造成小鼠结肠组织中Nlrp3、Asc、Caspase1和Il1β的m RNA表达水平增加（p<0.05）。与正常组小鼠相比，LPS处理的模型组小鼠结肠中Nlrp3表达水平上升约11.49倍，Asc表达水平上升5.16倍，Caspasee1表达水平升高7.17倍和Il1β表达水平升高10.23倍。而分别经玉米油和元宝枫籽油处理后，LPS处理后小鼠结肠组织中Nlrp3、Asc、Caspase-1和Il-1β的mRNA转录水平均明显低于LPS模型小鼠（p<0.05）。与LPS损伤组相比，元宝枫籽油干预能够分别抑制Nlrp3（41.80%）、Asc（49.85%）、Caspase-1（31.28%）和Il-1β（39.83%）的mRNA表达。Xie等[27]研究结果也同时提示经18周饲喂富含亚油酸（7%玉米油提供）的新鲜饲料能有效下调自发结肠炎模型鼠（Il-10-/-小鼠）结肠组织中Il-1β等炎症因子的表达水平。

图6 元宝枫籽油对LPS损伤小鼠结肠组织中Nlrp3、Asc、Caspase1和Il1β的mRNA转录影响Fig.6 Effects of Acer truncatum Bunge seed oil on mRNA levels of Nlrp3, Asc, caspase-1 and Il1β in colon of LPS-treated mice

3 结论

本研究发现，元宝枫籽油能有效缓解LPS诱导肠道损伤小鼠体重减轻和结肠缩短，抑制结肠组织上皮细胞凋亡，修复炎性反应所致肠黏膜损伤，进而恢复肠道屏障功能。能通过下调NLRP3炎性小体相关分子Nlrp3、Asc、Caspase1和Il1β的mRNA表达来改善肠道炎症反应。此外，元宝枫籽油还能减少结肠炎小鼠血清与结肠组织中炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18）的生成，降低结肠中MPO活性及MDA生产水平。综上所述，元宝枫籽油对肠道炎性损伤小鼠具有较好的组织修复和抗炎作用。