陈彦宏 曾申明

(中国农业大学 动物科技学院，北京 100193)

卵泡发育由一系列相互关联和高度协调的复杂事件组成，包括原始卵泡募集、颗粒细胞和膜细胞增殖、卵母细胞成熟和排卵等[1]。每个阶段的卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞层都会分泌大量的激素和细胞因子进行信息交流[2]。卵泡的生长和排卵伴随着颗粒细胞和膜细胞的增殖，并有炎症反应发生，所以免疫系统和内分泌系统都对卵巢功能起着非常重要的作用。大量的免疫组化结果表明，细胞因子作为繁殖过程中的主要介质之一，参与了卵巢功能的调节，在卵泡闭锁、排卵和黄体溶解过程中起重要作用[3]。例如，IL-1β可增强排卵前的颗粒细胞和间质细胞的基因表达[4]，以促进排卵[5]，同时也能调控颗粒细胞的类固醇生成[6]。研究表明，巨噬细胞参与调控卵泡发育和排卵，也对小鼠发情周期的正常进行起到至关重要的作用[7]。在生长小鼠的卵泡中，颗粒细胞与巨噬细胞共同培养，可增强颗粒细胞分泌孕酮[8]。这些结果表明巨噬细胞作为排卵过程中免疫反应的关键细胞之一，可能在卵泡发育的局部调控中发挥重要作用。

巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF)由各种免疫细胞分泌，通过抑制巨噬细胞迁移至炎症部位，进而参与细胞免疫[9]。MIF在先天免疫和后天免疫反应中都具有重要作用[10]。已有研究表明，MIF可激活淋巴细胞、粒细胞和单核/巨噬细胞[11]。此外，MIF可以中和类固醇激素，具有调节免疫系统的作用[11]。MIF还参与调节糖皮质激素介导的免疫抑制，促进细胞存活[12]。MIF参与巨噬细胞黏附和杀死肿瘤活性[13]。MIF 不仅有助于抵抗感染因子，而且对感染性、自身免疫性和变应性疾病中的细胞和组织损伤修复也有贡献[14]。多年以来，MIF被认为与急性炎症反应中的炎症因子(TNF-α、IL和IFN)分泌增加有关[15]。因此，MIF是炎症反应过程中的关键细胞因子之一。在关于卵巢功能的研究中发现，排卵是卵巢中最活跃的生物学过程之一，排卵过程常伴随着众多炎症反应，此时巨噬细胞则会释放细胞因子参与免疫调节反应[16]。有研究表明，健康女性排卵期血清中的MIF质量浓度显著高于卵泡发育期[17]。这些结果说明MIF 与卵泡发育和排卵机制有关。

猪作为多胎动物，在卵泡发育过程中，会有很多卵泡发育成熟或闭锁退化，这会引发卵巢的局部炎症反应[18]。Yang等[19]研究发现，在同一直径的母猪健康和闭锁卵泡中，健康卵泡MIF表达量显著高于闭锁卵泡。基于人和小鼠的多项研究，MIF参与人和小鼠的卵泡发育，具有参与调控免疫反应调控的能力。然而，MIF在母猪卵泡发育中的具体作用尚不清楚。因此，本研究旨在探究母猪不同直径健康卵泡中MIF表达变化规律，为母猪卵泡发育和排卵提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 样品准备

每次试验需要30个母猪卵巢，分3次，总共90个母猪卵巢，均来自于北京市兴星肉联厂。用含有1%青链霉素混合液的37 ℃生理盐水清洗卵巢。然后从母猪卵巢上选取不同直径的健康卵泡：大卵泡(L)：>6 mm；中卵泡(M)：3～4 mm；小卵泡(S)：1～2 mm。根据以上标准，用手术刀、小剪刀和小镊子，分离卵泡，并用游标卡尺测量卵泡直径，然后用10 mL注射器收集相应的卵泡液和颗粒细胞。首先，选取大、中和小卵泡，各抽取卵泡液15 μL，200 g 室温离心5 min，取上清液，通过ELISA检测MIF质量浓度；然后，选取大、中和小卵泡，各抽取卵泡液200 μL，200 g 室温离心5 min，取沉淀，用PBS重悬，再200 g室温离心5 min，弃上清，重复3次。在体视镜下，用口吸管将卵母细胞-卵丘细胞分离，只剩下颗粒细胞，通过实时荧光定量PCR和Western Blot检测MIFmRNA和蛋白表达量；最后，收集分离好的完整的卵泡，放于4% PFA-PBS溶液固定标本，通过免疫荧光检测MIF在颗粒细胞中分布状况。

1.2 卵泡液中MIF质量浓度测定

根据试剂说明书(上海机纯实业有限公司，JLC30201)配置标准品。先将标准品和待测卵泡液准确加入酶标包被板孔里，再用封板膜封板，置于37 ℃孵育30 min。孵育完成后，用洗涤液洗涤5次。再加入酶标试剂后37 ℃孵育30 min。完成后，同样洗涤5次。然后加入显色剂，37 ℃避光显色10 min，再添加终止液终止反应。最后将酶标包被板置于酶标仪(Bio-Rad iMark，USA)，用450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

1.3 实时荧光定量PCR检测卵泡中颗粒细胞MIF mRNA表达量

根据文献[20]提取猪卵泡的颗粒细胞RNA，再用微量紫外分光度计(Nano-300)测量RNA 的质量浓度与纯度，检测合格后，再用mRNA反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA。按照Invitrogen Platinum SYBR Green qPCR SuperMix -UDG试剂(Thermo Fisher，C11744-500)说明，以cDNA为模板，引物信息(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)如表1，然后进行实时荧光定量PCR反应(Bio-Rad CFX96 Touch，USA)。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence

1.4 卵泡中颗粒细胞MIF 蛋白质表达量测定

首先用RIPA裂解液裂解母猪颗粒细胞，提取总蛋白，再用BCA试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，DQ111-01)测蛋白质量浓度。取15 μL蛋白样和蛋白maker点样，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、洗膜。切割目的条带，分别与目的抗体4 ℃孵育过夜。再用TBST洗膜3次，加入ECL显色，最后使用曝光仪(Tanon5200，China)曝光。使用ImageJ(National Institutes of Health，NIH)软件进行灰度值分析。

1.5 检测MIF在颗粒细胞分布状况

分离的卵泡样本先组织复水，再进行抗原修复，然后用0.1%PBS-PVA室温清洗3次，再用0.5%Triton100-PBS 室温通透1 h。随后封闭、一抗(MIF，abcam ab175189)4 ℃孵育过夜，二抗(HRP山羊抗兔二抗 Servicebio GB23303)孵育，再用0.5%Triton-PBS清洗3次。染核和封片，最后用荧光显微镜(Olympus IX-70,Japan)观察。

1.6 统计分析

每个试验数据均由3次独立重复得出。试验数据用平均数±标准差(Mean±SD)表示，利用SPSS(Version 21.0)对数据使用单因素方差进行差异显著分析。实时荧光定量PCR数据使用2-ΔΔct方法计算结果，所得结果后再进行差异显著分析。当P<0.05(*)表示为差异显著，P<0.01(**)则表示为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同直径的健康卵泡液中MIF质量浓度

用注射器抽取猪不同直径的健康卵泡液，低速离心后取上清液，通过ELISA测得，在大卵泡(>6 mm)、中卵泡(3～4 mm)、小卵泡(1～2 mm)中，大卵泡的卵泡液里MIF质量浓度为(32.29±1.47) ng/mL，中卵泡为(54.17±7.86) ng/mL，小卵泡为(38.89±0.98) ng/mL，其中中卵泡卵泡液里的MIF质量浓度显著高于大卵泡和小卵泡卵泡液中的MIF质量浓度(P<0.05)(图1)。

大卵泡(L)，中卵泡(M)，小卵泡(S)；*表示差异显著P<0.05。Large follicle (L), medium follicle (M), small follicle (S); * indicates significant difference (P<0.05).图1 不同直径卵泡液中MIF质量浓度Fig.1 Concentration of MIF in follicular fluid of different diameters

2.2 不同直径的健康卵泡中颗粒细胞中MIF的表达

选取这类卵泡液里的颗粒细胞检测MIFmRNA的表达量，中等直径卵泡MIF的mRNA表达量显著高于大卵泡和小卵泡的表达量(P<0.05)(图2(a))。再通过Western Blot 检测颗粒细胞的MIF蛋白质量浓度，中等直径卵泡颗粒细胞 MIF蛋白质表达量也显著高于大卵泡和小卵泡表达(P<0.05)(图2(b)和(c))。

2.3 MIF在颗粒细胞的分布

分离出不同直径健康卵泡，通过免疫荧光检测MIF在颗粒细胞的分布状况，由图3可看到，MIF主要集中在卵泡颗粒细胞里，颗粒细胞的细胞核和细胞质中均有分布，但主要集中分布于细胞质。

大卵泡(L)，中卵泡(M)，小卵泡(S)；*表示差异显著P<0.05Large follicle (L), Medium follicle (M), Small follicle (S); * indicates significant difference (P<0.05)(a) MIF mRNA表达量；(b)和(c) MIF蛋白表达(a) MIF mRNA expression; (b) and (c) MIF protein expression图2 不同直径卵泡中颗粒细胞中MIF的表达Fig.2 MIF expression in granulosa cells of different diameter follicles

3 讨 论

本研究发现中等直径健康卵泡液的MIF质量浓度最高，小卵泡和大卵泡的MIF含量较少。Wada等[21]研究发现，健康女性卵巢卵泡液中MIF 的质量浓度随卵泡直径增大而减少。而且Matsuura 等[22]添加抗MIF 抗体处理卵巢后，与对照组相比，发现有腔卵泡数量减少，卵泡发育停滞，排卵数显著减少(P<0.05)。在进行IVF胚胎移植的患者中，Wada 等[23]测定了血清MIF质量浓度的变化，在排卵当天MIF质量浓度达到了最大值。小鼠腹腔内注射人绒毛膜促性腺激素显著增加卵泡液中MIF的质量浓度[23]。此外，在颗粒细胞培养基中，添加人绒毛膜促性腺激素刺激后，培养基中MIF质量浓度显著升高[23]。因此，MIF参与卵泡发育与排卵。

以前主流观点认为MIF一般由各种免疫细胞分泌。本研究通过免疫荧光发现，MIF大量集中于颗粒细胞的细胞质中。Wada等[21]通过使用免疫组织化学研究，蛋白质印迹分析和实时荧光定量PCR等方法，证明了培养人卵巢上的颗粒细胞能表达MIF。这都充分说明，颗粒细胞能表达MIF。另外，促性腺激素主要作用于卵巢。为应对促性腺激素的刺激，卵巢上的颗粒细胞、免疫细胞和其他细胞都可能产生MIF，从而导致MIF 在卵泡液和血液的质量浓度增加。Calan等[17]研究发现，在健康女性血清中，排卵期的MIF质量浓度显著高于卵泡发育期。基于快速的诱导免疫反应，排卵被认为是一种炎症反应。例如白细胞的大量涌入，其可分泌大量细胞因子参与调控[24]。这些白细胞(包括淋巴细胞，粒细胞和巨噬细胞)通过分泌一系列蛋白酶和细胞因子促进排卵[25]。巨噬细胞也在排卵过程中执行多种功能，包括分泌细胞外基质重塑的基质金属蛋白酶和参与颗粒细胞闭锁的吞噬作用[26-27]。淋巴细胞还通过选择性产生一系列细胞因子来促进卵泡发育[28]。同样，Van der Hoek等[7]通过使用氯膦酸脂质体处理卵巢，小鼠的巨噬细胞数量和排卵数减少，发情间期延长，说明卵巢皮质上的巨噬细胞可能参与调节卵泡的生长和排卵，并对小鼠发情周期有一定影响。由于排卵期间卵巢内会出现类似炎症反应，循环血液及卵泡液中的炎症因子(MIF、TNF、IFN和NO等)均上升表达[29]。细胞因子间可相互作用，MIF可诱导细胞分泌TNF、IFN和IL-1，从而刺激细胞反应性表达[30]。本研究结果显示，中等直径卵泡颗粒细胞中MIFmRNA和蛋白质表达量也显著高于大卵泡和小卵泡中的表达量(P<0.05)。所以MIF 在卵巢中可能是通过激活巨噬细胞来发挥作用，其可在卵泡生长发育和排卵过程中诱导其他生长因子的表达，为卵泡排卵做好准备。因此，MIF在卵泡发育过程中出现的质量浓度变化可能与排卵有着密切关系。

综上，随着母猪卵泡发育过程，MIF在健康的中卵泡中大量表达，小卵泡和大卵泡表达量都较少。这为母猪卵泡发育和排卵提供新的线索。后续研究应当着重关注MIF为何在中等直径卵泡中表达量最高，以及如何调控其它炎症因子，促进卵泡发育与排卵。