LED脉冲光对生菜叶绿素荧光参数的影响

2021-11-04梅延豪虞慧彬白雅晖徐晓东武永军杨振超

中国农业大学学报 2021年9期

梅延豪刘齐李琦虞慧彬白雅晖徐晓东武永军杨振超*

(1.西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学生命学院，陕西杨凌 712100)

叶绿素荧光与植物光合作用的关系十分密切，常常被用作快速检验植物光合作用的探针。使用各种荧光参数可反映光合作用中光合反应中心各个电子传递体的活跃状态、电子传递速率、CO2同化速率及能量分配的情况[1-5]。

发光二极管(Light-emitting diode，LED)在植物工厂和温室等可控环境下的作物补光领域得到了飞速的发展，很大程度上弥补了传统光源在设施农业生产中的不足。然而，作物补光所造成的成本输出仍占很大比重，继续研发高效节能的植物补光灯势在必行[6-7]。

LED的特性之一是可以发射间歇性的脉冲光，它由脉冲宽度调制(PWM)方法产生，在照明系统中提供各种频率和占空比(光亮时间占整个光-暗周期的比值)[8]。相比连续光，脉冲光似乎更有利于植物光合效率的提高。实际上，植物下半部分叶片接收到的光是透过上层叶片摆动产生的间歇性太阳光，而非连续的，且这些叶片在非连续光下生长依然良好[9]。波动的光环境与光合作用动力学之间的关系比较复杂，这对于研究生态系统中的植物及其性能至关重要[10]。Tennessen等[11]研究表明，番茄植株对脉冲LED的光合响应优于对连续光照的响应。Son等[12]研究表明占空比为75%，1、10和30 kHz 频率下的脉冲光对生菜生长的影响，相比连续光，生菜叶片的光合速率没有显著性差异；除了30 kHz的脉冲光外，其他组合的脉冲光都提高了光能利用率，并且频率越高，光能利用率越低。王晓旭等[13]在研究不同脉冲光处理生菜时发现，各处理间生菜的形态、品质和净光合速率都有差异，低频率和低占空比的脉冲光虽然耗电量低，但不利于叶绿素的合成和光合作用。牟孙涛等[14]发现，瞬时光强一定时，随着频率和占空比的增加，净光合速率也在增加，且在一定频率和占空比组合的脉冲光下的净光合速率与连续光无显著差异。这说明脉冲光的研究有望在不抑制植物生长的情况下降低LED能耗，节约能源[15]。然而，植物在某些特定脉冲光照射下能达到与连续光基本相同的净光合速率至今未探索出其机理性原因。因此，在前期研究的基础上，本研究利用荧光仪测定了生菜叶片的叶绿素荧光参数，旨在探究脉冲光对生菜叶绿素荧光的影响，以期为研发适宜生菜正常生长的高效节能补光灯提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2019年10月—2020年8月在西北农林科技大学园艺学院设施农业生物与环境工程实验室进行。供试材料为玻璃生菜(LactucasativaL.)，种子由青县现代农业技术推广中心提供。光源采用西安因变光电科技有限公司生产的LED灯板和LED控制系统V1.0，可调节LED的光照强度、频率和占空比。LED灯板尺寸为35 cm×35 cm，距培养架底部的起始距离为43 cm。

将催芽后的生菜种子播种于72孔的穴盘中，置于人工气候箱进行常规管理。气候箱光/暗时间分别设为14 h和10 h，光期温度为22 ℃，空气相对湿度为65%；暗期温度为20 ℃，空气相对湿度为60%。播种25天后，选取4叶1心且长势整齐的幼苗定植于7 cm×7 cm×7 cm的营养钵中，然后转移至实验室内LED灯板下分别进行处理。

1.2 试验设计

试验设置14个频率水平(1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024、2 048、4 096和8 192 Hz)和5个占空比水平(20%、40%、60%、80%和100%)，共计70个组合，其中100%占空比为连续光对照。脉冲光和连续光的瞬时光强均设为200 μmol/(m2·s)，光周期为14 h/10 h。定植后的生菜分别在设定不同频率和占空比的LED灯板下处理10 d，第11天测定各处理的叶绿素荧光指标，试验共重复3次。

1.3 项目测定

利用双通道调制叶绿素荧光仪DUAL-PAM-100(WALZ，德国)测定。处理第11天时，每个处理随机选5株生菜，选取生长点下第5片功能叶测定。测量前，利用DLC-8叶夹先将需测定的生菜叶片暗适应30 min，然后打开测量光，记录暗适应后的最小荧光Fo；紧接着打开1个持续时间0.3 s的饱和脉冲光，测量并记录暗适应后的最大荧光Fm；饱和脉冲光关闭后荧光迅速回到Fo附近，然后打开光化光，记录叶绿素荧光从黑暗转到光照的响应过程，待荧光曲线达到稳态后关闭光化光，结束整个测量过程，记录并保存荧光数据。叶绿素荧光的基本参数包括：暗适应下的初始荧光Fo和最大荧光Fm；光适应下的最小荧光Fo′、稳态荧光Fs和最大荧光Fm′。其他具体荧光参数名称及公式如表1[16]。

表1 叶绿素荧光参数及计算公式Table 1 Chlorophyll fluorescence parameters and calculation formula

1.4 分析方法

采用Microsoft Excel 2013进行数据整理，采用SPSS 23.0进行单因素方差分析(ANOVA)，利用Duncan检验处理间差异的显著性水平(P<0.05)，采用Origin 2017软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同脉冲光处理对生菜叶片Fv/Fm和Fv/Fo的影响

叶绿素荧光参数Fv/Fm和Fv/Fo分别反映了植物叶片PSII原初光能转换效率和PSII潜在活性的大小[17]。由图1(a)可看出，占空比为20%时，脉冲光频率低于256 Hz的生菜叶片的Fv/Fm值显著低于连续光处理；占空比为40%、频率为4～64 Hz以及占空比为60%和80%、频率为16 Hz时，脉冲光处理的生菜叶片Fv/Fm值同样显著低于连续光处理。占空比为40%和60%、频率为256～512 Hz以及占空比为80%、频率为分别为64 和256 Hz时，脉冲光处理的生菜叶片的Fv/Fm值要显著高于连续光处理，其他脉冲光处理Fv/Fm值均与连续光无显著差异。由图1(b)可看出，Fv/Fo的分析结果与Fv/Fm相似，占空比为20%时，除了256 Hz以下的Fv/Fo值显著低于连续光外，其余脉冲光处理均不低于连续光。以上结果表明，低频率和低占空比的脉冲光处理会降低生菜叶片的Fv/Fm和Fv/Fo值，而高频率或高占空比对生菜叶片的光合能力没有显著影响。

2.2 不同脉冲光处理对生菜叶片光下PSII光化学效率的影响

Fv′/Fm′反映的是PSII反应中心完全开放时的最大光化学量子效率[18-19]。由图2(a)可知，占空比为20%、40%、60%和80%时，频率分别达到256、256、128和32 Hz及以上的Fv′/Fm′值与连续光无显著差异。此外，占空比为40%～60%、频率为1～2 Hz以及占空比为80%、频率为1～4 Hz时，脉冲光处理的Fv′/Fm′值同样与连续光Fv′/Fm′值无显著差异。由图2(b)可知，当频率高于128 Hz时，不同占空比对生菜叶片ΦPSII值均没有显著差异。脉冲光的频率为128 Hz及以下时，当占空比为60%，1～2 Hz的ΦPSII值与连续光无显著差异；当占空比为80%，除8～16 Hz外，其余ΦPSII值均与连续光无显著差异。综上，当不同占空比脉冲光的频率增长到一定数值时，其对生菜叶片的光化学量子效率没有显著影响，而低于这些频率会对光化学量子效率造成影响，导致光合效率降低。

折线上的误差线表示不同占空比处理间的差异显著水平，P<0.05。下同。Error lines on the broken line indicate the significant level of difference among different duty ratio treatments, P<0.05. The same below.图1 不同脉冲光处理对生菜叶片Fv/Fm(a)和Fv/Fo(b)的影响Fig.1 Effects of different pulsed light treatments on Fv/Fm (a) and Fv/Fo (b) of lettuce leaves

图2 不同脉冲光处理对生菜叶片Fv′/Fm′(a)和ФPSII(b)的影响Fig.2 Effects of different pulsed light treatments on Fv′/Fm′ (a) and ФPSII (b) of lettuce leaves

2.3 不同脉冲光处理对生菜叶片荧光淬灭的影响

光化学淬灭qP反映了PSII反应中心的开放程度和原初电子受体QA的还原状态；非光化学淬灭NPQ反映的是PSII天线色素吸收的光能以热的形式耗散掉的部分[20]。由图3(a)可以看出，占空比为20%和40%时，频率分别达到256 Hz和128 Hz及以上的qP值与连续光无显著差异；除占空比为60%、频率为4和16 Hz以及占空比为80%、频率为16 Hz时，脉冲光处理的qP值显著低于连续光外，其他处理均与连续光无显著差异，说明绝大多数高占空比的脉冲光处理不会影响生菜叶片PSII反应中心的活性。由图3(b)可以看出，占空比为20%、40%和60%，频率分别达到512、256和256 Hz及以上时，脉冲光处理的NPQ值与连续光处理无显著差异；占空比为80%时，除16～64 Hz的NPQ值显著高于连续光外，其余均与连续光无显著性差异；而频率为1 Hz时，40%～80%占空比脉冲光处理的NPQ值同样与连续光无显著性差异。以上结果说明，不同占空比的低频率脉冲光处理会导致生菜叶片吸收的光能转换为热的部分增加，高频率不会对此造成影响。另外，除了20%占空比的1 Hz脉冲光也不会导致热耗散增加。

图3 不同脉冲光处理对生菜叶片qP(a)和NPQ(b)的影响Fig.3 Effects of different pulsed light treatments on qP (a) and NPQ (b) of lettuce leaves

2.4 不同脉冲光对生菜叶片非光化学耗散量的影响

ΦNO代表的是被动地耗散为热量和发出荧光的能量，主要由关闭态的PSII反应中心贡献；ΦNPQ代表的是通过调节性的光保护机制耗散为热的能量[18-20]。由图4(a)可以看出，占空比20%～40%、频率1～2 Hz 组合的ΦNO值显著高于连续光及其他处理，分别比连续光高出了13.54%、12.23%、20.00%和5.78%，而其余脉冲光处理与连续光相比均无显著差异，说明除了1～2 Hz的低占空比外，脉冲光不会导致生菜叶片的ΦNO升高或降低。由图4(b)可知，频率低于256 Hz时，20%占空比脉冲光处理的ΦNPQ值显著高于连续光处理；占空比为40%～60%、频率为2～128 Hz以及占空比为80%、频率为8～128 Hz时，脉冲光处理的ΦNPQ值同样显著高于连续光处理。相反，频率为256 Hz及以上时，脉冲光处理的ΦNPQ值与连续光无显著差异。结果表明256 Hz及以上频率不会对生菜叶片的ΦNPQ产生影响，256 Hz以下频率的大部分脉冲光处理会导致PSII调节性热耗散能量的增加。

图4 不同脉冲光处理对生菜叶片ΦNO(a)和ΦNPQ(b)的影响Fig.4 Effects of different pulsed light treatments on ΦNO (a) and ΦNPQ (b) of lettuce leaves

3 讨论

3.1 脉冲光对PSII反应中心活性的影响

目前利用叶绿素荧光测量来检测植物的光合性能和胁迫作用，已广泛应用于植物生理和生态生理研究中[17]。PSII最大光量子效率Fv/Fm的下降常作为衡量光抑制的指标，在非胁迫条件下Fv/Fm的正常或最佳值通常在0.83左右[3]。本研究分析得出，大部分脉冲光处理的Fv/Fm值与连续光没有显著性差异，说明这些脉冲光处理未对生菜的光合能力造成伤害，这与Son等[21]的研究结果一致；而20%占空比、256 Hz以下及40%占空比的部分低频脉冲光处理的Fv/Fm和Fv/Fo要低于正常水平，原因可能是低频率和低占空比的脉冲光使得生菜叶片的PSII发生了光抑制现象。频率128 Hz及以下低占空比的脉冲光处理生菜叶片qP和Fv′/Fm′低于连续光，说明低频低占空比的脉冲光处理降低了生菜PSII反应中心的开放程度。低频低占空比脉冲光下的NPQ明显高于连续光和其他脉冲光处理，说明这些脉冲光处理会导致生菜叶片吸收的光能用于热耗散的比例上升，而参与光合电子传递的能量会减少，影响了光化学反应的顺利进行。

Fv/Fm、Fv/Fo、qP、NPQ和Fv′/Fm′这5个荧光参数可用来反应植物叶片PSII反应中心的活性，从试验结果来看，低频率低占空比的脉冲光会导致PSII活性降低，原因可能与暗期时间有关。低频率低占空比的脉冲光的暗期时间较长，而植株在光期所吸收的光量子数不足以维持整个光-暗周期的1,5-二磷酸核酮糖(Ribulose-1,5-bisphosphate，RuBP)缓冲池的能量平衡[22-23]，导致在暗期的后半阶段光子数不足，光合反应不能持续稳定下去。这种不平衡会给植株在某一平均时间段造成类似于弱光的环境，对PSII形成了弱光条件下的光抑制，使得PSII的活性降低。相反在高频率或高占空比的脉冲光下，暗期时间较短，不会对植株PSII的活性造成影响。

3.2 脉冲光对生菜叶片光合电子传递的影响

光合作用中受光激发从H2O中分离出来的电子从PSII出发，经过质体醌库(Plastoquinone pool，PQ pool)、细胞色素b6f和质体蓝素(Plastocyanin，PC)等一系列载体的传递，最终产生同化力ATP和NADPH，这些产物为暗反应过程提供还原力和能源，将CO2固定并转化为生物可利用的糖类物质[24-26]。叶绿素荧光参数ΦPSII、ETR和ΦCO2可用来反映光合作用中光合电子传递的情况，且ΦPSII与光合速率直接相关[27]。

占空比影响LED辐射总时长和叶片吸收的总光量子数。在低于256 Hz的脉冲光下，随着占空比的增加ΦPSII呈现上升的趋势，说明占空比越高，越有利于促进植株叶片的光合电子传递效率的提高，这与Dong等[28]的研究结果一致。CO2同化量子效率ΦCO2和光合电子传递速率ETR是判断光处理影响生菜生长的指标，并由直接依赖UPSII参数的线性方程表示[4]。这意味着，如果ΦPSII增加，参数ETR和ΦCO2也会提高。但除了部分高占空比的脉冲光外，其余处理均低于连续光，这可能与反应中心的活性有关[29]，即低频率低占空比脉冲光处理下生菜叶片PSII活性降低，导致了电子由PSII反应中心向QA、QB和PQ库的传递过程中受到抑制。

相反在256 Hz及以上的高频和部分低频高占空比的脉冲光处理对ΦPSII、ETR和ΦCO2无显著影响，这种情况可能与光合系统中存在的某个或某些缓冲池有关[30]。Emerson和Arnold[31]通过观察不同脉冲光处理下绿色微藻的净光合速率得出，光反应比暗反应的反应速度快得多。Tennessen等[11]报道了脉冲光照下番茄叶片的净光合速率在小于100 Hz 时随频率的降低而下降，并估计了PSII的池大小。整个光合系统存在多个缓冲池，如PQ库和NADPH池，亦可称为光合作用的限速步骤[32]。高频或高占空比脉冲光处理下的参数ΦPSII、ETR、ΦCO2与连续光处理没有显著差异，可能是植物叶片对于连续光吸收的光量子有剩余，而剩余的光量子会以某种光合中间体的形式储存起来。换句话说，高频率或高占空比的脉冲光正是充分利用了缓冲池所储存的中间产物，维持了光反应和暗反应之间的动态平衡[33]。因此，高频或高占空比的脉冲光没有对植物叶片光合系统造成影响。然而，脉冲光通过响应其中一个还是多个缓冲池来维持稳定的光合电子传递，至今未有一个明确的解释，仍需进一步探究。

3.3 脉冲光对生菜叶片PSII能量分配的影响

PSII的量子产额可分为实际的光化学量子产额ΦPSII和非光化学耗散的量子产额ΦNPQ+ΦNO，其中ΦPSII代表PSII吸收后用于光化学反应的那部分能量，且ΦNO+ΦPSII+ΦNPQ=1[34-35]。频率256 Hz以下除部分高占空比外，非光化学耗散量ΦNO+ΦNPQ要明显高于连续光处理，说明在256 Hz以下低占空比的脉冲光致使生菜叶片吸收的光能用于光化学反应的份额会降低。在1 Hz和2 Hz的低占空比脉冲光下，非调节性的能量耗散量子产额ΦNO明显高于连续光及其他脉冲光处理，且与其他低频脉冲光相比，ΦNO在非光化学耗散量总和中所占的比值要高，可能这种低频低占空比的脉冲光已经使生菜光保护能力遭到破坏，严重影响了植株叶片的光合作用。而其他处理的ΦNO与连续光均无显著性差异，仅仅是在256 Hz以下频率的ΦNPQ有所增加。ΦNPQ是植物光保护的重要指标，在光能的分配方面，ΦNPQ与ΦPSII呈负相关，低频低占空比的脉冲光导致用于光反应的能量降低，而ΦNPQ相应的增加说明了植物叶片仍可将无法用于光反应的能量转化为热来保护自身[36]。另外，在部分低频高占空比和256 Hz及以上频率的脉冲光处理下ΦPSII、ΦNPQ和ΦNO三者均与连续光无显著差异，说明了在高频率或高占空比的脉冲光下不会对生菜叶片PSII反应中心的能量分配造成影响。

3.4 LED脉冲光的应用对作物生产的影响

随着植物照明技术的应用，人工补光所带来的运营成本问题也得到了广泛关注，其造成的电力消耗就占植物工厂总耗电的75%～80%[37]。脉冲光作为一种高频率的频闪光，使得电能节约成为可能[38]。前期研究发现，脉冲光占空比一定时，当频率达到某一水平，生菜的净光合速率与连续光没有显著差异[14]，并且本研究进一步证实，在不降低净光合速率的这些脉冲光中，同样不会对作物的光合系统及能量分配造成影响。在不影响光合的前提下，脉冲光的占空比越低，光能利用率就越高。因此，在20%占空比、512 Hz以上的光能利用率能达到最高。但耗电量并不和光能的总输出完全一致，LED脉冲光的耗电情况受静态功耗(受占空比影响)和动态功耗(受频率影响)的影响[38]，所以具体的节能效果仍需结合LED脉冲光的耗电情况进一步探究。此外，本研究结果仅适用于植物工厂中生菜的种植，其他作物对脉冲光叶绿素荧光的响应可能会有不同，需要通过试验进行验证。