于沛，何贺，钞艳惠，聂会娟

(郑州大学第一附属医院药学部，郑州 450052)

炎症性肠病是临床常见肠道疾病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)[1-2]。UC发病机制至今尚不明确，有研究表明其发病具有家族遗传性[3]。临床上UC治疗难度较大，治疗过程中易复发，表现为严重反复的腹泻、便血和腹痛，患者体质量持续下降[4]。患者生活质量低下，身心备受折磨，并且长时间持续炎症反应会增加癌症风险，严重威胁患者生命安全[5]。基于此，在现有临床治疗基础上寻找更好的治疗方案成为研究重点。美沙拉嗪(5-aminosalicylic acid，5-ASA)是临床治疗急性UC的首选药物，具有良好的治疗效果，但治疗过程中复发率较高，临床应用受到限制[6-7]。近年来研究表明，UC发生与患者肠道菌群失调密切相关[8-11]。肠道菌群稳态对肠道健康至关重要，二者相互影响，密不可分。因此，维持肠道菌群稳态是治疗UC的新途径[12]。膳食纤维是良好的益生元，可以调控肠道菌群[13-16]。笔者在本研究比较膳食纤维联合5-ASA和5-ASA治疗UC的疗效，并对其治疗机制进行初步探索，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验试剂 葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS，美国MP公司，平均相对分子质量36 000～50 000，批号：160110)，隐血试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：C027-1-1)；髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A044-1-1)；羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na，国药集团化学有限公司，批号：170610)；5-ASA(上海爱的发制药有限公司，批号：160306)；小鼠白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及IL-10酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号分别为ml028611、ml00209、ml06315和ml037873)；燕麦、玉米、红豆、花生和莲子购于超市；动物组织裂解液(上海生物工程有限公司，批号：C500028)；RNA提取、逆转录以及定量试剂盒[宝日医生物技术北京有限公司TaKaRa(中国)，批号分别为9767、RR036A、6396760]；其余试剂均为国产分析纯。

1.2实验仪器 BioTek Epoch 酶标仪(美国BioTek公司，Epoch)，LXJ2I 型离心机(上海医用分析仪器厂)，85-2型恒温磁力搅拌机(上海斯乐仪器厂)，定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(美国罗氏公司，Light Cycle-96)，电子分析天平E11140(德国梅特勒公司，感量：1 mg)，GZX-9023 MBE数显鼓风干燥箱(上海博讯实业医疗设备厂)，NURO-5T自动双重纯水蒸馏器(宁波科学仪器有限公司)，MiSeq高通量测序仪(美国Illumina公司)。

1.3实验动物 雌性6～8周龄无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠，实验动物合格证号：NO.201615478，体质量18～20 g，购自扬州大学比较医学研究中心，实验动物生产许可证编号：SCXK(苏)2017-0007。小鼠饲养在光照12 h/黑暗12 h房间，温度25 ℃，恒湿(相对湿度30%)。

1.4模型的建立 小鼠适应性饲养7 d，自由饮用3.5%DSS溶液(以纯化水配制)7 d，建立急性UC模型，42只小鼠建模成功[17]。

1.5膳食纤维饲料的制备 称取50 ℃烘干过夜的燕麦、玉米、红豆、花生各100 g，莲子30 g，粉碎成粉末，以料液比1：100加入纯化水，50 ℃搅拌2 h，50 ℃烘干1 h，得含少量水分的糊状混合成分。将糊状混合成分装入饲料模具定型，烘干后得膳食纤维饲料[18]。

1.6动物分组与给药 设未造模小鼠为正常对照组，将模型小鼠根据体质量按完全随机分组方法[19]分为模型对照组、5-ASA组和膳食纤维联合5-ASA组(F-5-ASA组)。5-ASA组与F-5-ASA 组以5-ASA灌胃(5-ASA以0.5% CMC-Na配制成混悬液)，200 mg·kg-1；正常对照组与模型对照组灌胃相同剂量0.5% CMC-Na。正常对照组、模型对照组及5-ASA组给予正常饲料喂养7 d，F-5-ASA组给予膳食纤维饲料喂养7 d。

1.7检测指标与检测方法 每天记录小鼠体质量、便血及腹泻情况，并按文献方法进行疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分。末次给药后处死，解剖，取回肠至肛门处结肠，测量长度并摄相。纵向剪开结肠，取结肠内容物置EP管，-80 ℃冰箱保存。剪取适当长度(约1.0 cm)，10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色。剩余组织立即置液氮保存。

1.8结肠组织炎症相关蛋白质表达情况检测 取液氮保存的结肠组织100 mg，置研钵，分3次加液氮，每次10 mL，快速充分研磨，加入组织裂解液1 mL，继续研磨，直至无明显块状组织。取液体500 μL，转移至1.5 mL EP管，冰浴超声处理20～30 s，10 000 r·min-1离心10 min(r=8 cm)。取上清液。按照ELISA试剂盒说明书操作流程，检测结肠组织IL-1β、IL-6、TNF-α以及IL-10蛋白表达情况。

1.9小鼠肠道菌群的检测 取-80 ℃冰箱冻存的小鼠结肠内容物50 mg，每组小鼠样本5只，进行肠道菌群16 s RNA测序(金唯智生物科技有限公司，苏州)。即采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGG-TWTCTAATCC ”序列的下游引物扩增细菌V3和V4区，构建测序文库，使用Illumina MiSeq仪器进行双端测序，并对数据进行生物信息学分析。利用PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states )预测菌群代谢途径，采用STAMP软件比较组间可视化差异菌群代谢途径。

2 结果

2.1小鼠一般情况 见图1。正常对照组小鼠体质量无明显变化；模型对照组、5-ASA组及F-5-ASA组小鼠从第5 天开始体质量明显下降，给予5-ASA或者F-5-ASA后小鼠体质量缓慢上升。实验第14天，与正常对照组比较，模型对照组小鼠体质量显著降低(P<0.01)；与模型对照组比较，5-ASA组与F-5-ASA组体质量明显上升(P<0.01)。小鼠DAI评分见图1B，正常对照组实验过程中DAI无明显波动，模型对照组呈逐渐上升趋势，5-ASA组与F-5-ASA组先上升后逐渐下降。与正常对照组比较，模型对照组第14天DAI评分显著增高(P<0.01)；与模型对照组比较，5-ASA组与F-5-ASA组DAI评分较低。第14天各组小鼠结肠长度见图1C、D。与正常对照组比较，模型对照组小鼠结肠显著缩短(P<0.01)；与模型对照组比较，5-ASA组与F-5-ASA组结肠明显更长(P<0.01)，提示5-ASA与F-5-ASA能有效缓解小鼠结肠炎症反应。

2.2小鼠结肠切片形态学 见图2。正常对照组小鼠结肠黏膜完整，固有层黏膜下层及肌肉层分层明显，结构整齐清晰，隐窝排列整齐，无炎性细胞浸润；模型对照组小鼠结肠组织无明显结构层次，黏膜脱落，腺体和隐窝消失且有大量炎性细胞浸润；5-ASA组与F-5-ASA组小鼠结肠组织结构层次重构，黏膜重塑，隐窝可见且有少量炎性细胞浸润。病理检查结果表明，5-ASA与F-5-ASA对小鼠肠黏膜有良好保护作用，可改善肠黏膜损伤，减轻炎症反应。

2.3炎症因子测定结果 见图3。与正常对照组比较，模型对照组小鼠结肠大量表达IL-1β、IL-6及TNF-α，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，5-ASA组IL-1β和TNF-α表达均下调；与模型对照组比较，5-F-ASA组上述3种促炎细胞因子表达均显著下调。IL-10检测结果见图3D，与正常对照组比较，模型对照组表达量显著下调(P<0.01)；与模型对照组比较，5-ASA组和5-F-ASA组均显著上调(均P<0.01)。上述结果表明，5-ASA与5-F-ASA对小鼠结肠炎症具有治疗作用，且5-F-ASA疗效优于5-ASA。

①与正常对照组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.01。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.5-ASA组；D.F-5-ASA组。

①与正常对照组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.01。

2.4小鼠肠道菌群多样性测定结果 由图4A可知，与正常对照组比较，模型对照组小鼠肠道菌群多样性降低；与模型对照组比较，5-ASA组与F-5-ASA组肠道菌群多样性增加，表明5-ASA和F-5-ASA对小鼠肠道菌群有调控作用。由图4B PCoA分析可知，主成分Axis.1和Axis.2之和达到64.7%，4组之间差异有统计学意义，表明4组小鼠肠道菌群组成有明显差异。

图4 4组小鼠肠道菌群测定的α 和 β多样性

2.5小鼠肠道菌群丰度测定结果 由图5A-D可知，在门分类水平上，正常对照组、5-ASA组及F-5-ASA组主要以拟杆菌门(bacteroidetes)为主，相对丰度分别为47.0%，45.0%和49.0%；其次是厚壁菌门(firmicutes)，分别为35.0%，31.0%和26.0%；模型对照组主要以厚壁菌门为主(相对丰度51.0%)，其次是拟杆菌门(相对丰度31.0%)。表明5-ASA与F-5-ASA能够改善由DSS所致肠道菌群紊乱。图5E-F显示在属水平上各组小鼠菌群分布差异情况。4组小鼠肠道菌群丰度差异可从LEFse分析看出，模型对照组与其他3组比较，差异有统计学意义(LDA>2)的菌属有5种，分别是Oscillospira、Odoribacter、Dorea、Lactobacillus和Coprococcus。5-ASA组有3种，分别为MUcispirillum、Butrricimonas和Pseudomonas。F-5-ASA组差异有统计学意义的菌属有9种，其中差异最大的属是Bacteroides，其次是Parabacteroides、Campylobacter、Helicobacter和Eubacterium等。

2.6小鼠肠道菌群代谢功能 见图6。通过与Clusters of Orthologs Groups (COG) 数据库比对，DSS处理小鼠后共有25种代谢途径显著改变。其中肠阿米巴病(amoebiasis)代谢、氨基酸代谢(amino acid metabolism)及脂肪酸代谢(fatty acid metabolism)途径被显著上调，而包括硫胺素代谢(thiamine metabo-lism)、原发性免疫缺陷(primary immunodeficiency)和半乳糖代谢(galactose metabolism)在内的22种代谢途径被显著抑制(图6A)。与模型对照组比较，5-ASA组12种代谢途径显著改变。其中硫胺素代谢(thiamine metabolism)，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis)，碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)，氮代谢(nitrogen metabolism)以及限制酶(restriction enzyme)代谢途径被显著下调，丁酸代谢(butanoate metabolism)、丙酸代谢(propanoate metabolism)、氯代烷烃和氯代烯烃降解(chloroalkane and chloroalkene degradation)、醚脂代谢(ether lipid metabolism)、RIG-I样受体信号通路(RIG-I-like receptor signaling pathway)、氨基酸代谢(amino acid metabolism)和萘降解(naphthalene degradation)代谢途径显著上调(图6B)，表明5-ASA可提高小鼠肠道内细菌功能。F-5-ASA组小鼠肠道细菌功能有极大改变(图6C)。由图6可知，与模型对照组比较，F-5-ASA组有45种代谢途径被显著改变，其中22种上调，23种下调。上调代谢途径包括碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine，tyrosine and

tryptophan biosynthesis)和氨基酸代谢(amino acid metabolism)等，下调途径包括丙酸代谢(propanoate metabolism)、细菌趋化性(bacterial chemotaxis)和细菌运动蛋白(bacterial motility proteins)等代谢途径(图6C)。

A.正常对照组门分类水平相对丰度；B.模型对照组门分类水平相对丰度；C.5-ASA组门分类水平相对丰度；D.F-5-ASA组门分类水平相对丰度；E.属分类水平菌群丰度热图；F.LEfSe分析中显示的各组差异菌属。

3 讨论

UC常年反复发作，极大地影响患者生活质量，威胁患者生命。5-ASA是已经上市的急性UC治疗药物，其主要药理作用机制为抑制前列腺素及白三烯生物合成。口服5-ASA可有效缓解炎症，改善临床症状，短期治疗可以达到良好效果，但远期治疗易复发，效果不佳。

以DSS建立UC模型由日本学者于1985年提出，小鼠在自由饮用一定浓度DSS后会自发出现肠炎，此种肠炎病理学表现与临床UC患者相似，在研究UC发生和发展中发挥着重要作用。笔者在本研究中采用3.5%DSS造模，小鼠自由饮用4 d后出现明显体质量减轻、便血和腹泻症状，14 d后病理切片显示结肠部位炎症细胞浸润严重，结肠组织完整结构破损，提示模型建立成功。

在盲肠和结肠，肠道菌群代谢产物是肠黏膜上皮细胞主要能量和营养来源。研究表明，肠道微生物在维持肠道微环境稳态中发挥重要作用。短链脂肪酸(如乙酸、丙酸和丁酸)是肠道微生物发酵食物中难消化的碳水化合物产生的小分子化合物。短链脂肪酸被小肠上皮细胞吸收，通过以下途径发挥抗炎作用：①为肠上皮细胞提供直接能量；②激活上皮细胞G蛋白耦联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs，主要有GPR41、GPR43和GPR109A)；③抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)活性，从而调控基因表达。IBD 中短链脂肪酸显著降低，可能是影响内部和免疫稳态的关键因素。研究表明，临床UC患者粪便肠道菌群表现为多样性降低，有益菌群丰度减少或消失，有害菌群大量繁殖[10]。机体发生炎症时，有害菌群代谢物(如脂多糖)会损伤肠道黏膜，使肠道免疫系统紊乱，加剧炎症进程。研究表明，调控炎症所致肠道菌群紊乱是治疗UC的新思路新方法。膳食纤维已被大量研究证明对肠道菌群具有良好调控作用。ZHAO等[20]研究表明，将燕麦、玉米、红豆、薏米、荞麦、山药、花生和莲子做成复合膳食，2型糖尿患者使用3个月，能够通过调控患者失衡的肠道菌群，从而极大改善患者临床症状。

A.正常对照组与模型对照组比较；B.模型对照组与5-ASA组比较；C.模型对照组与F-5-ASA组比较。

本研究中，笔者选择燕麦、玉米、红豆、花生和莲子制备膳食，饲喂肠炎小鼠7 d，同时给予5-ASA治疗7 d。结果表明，F-5-ASA组小鼠治疗后体质量、DAI以及结肠长度均明显低于模型对照组，且效果优于5-ASA组。病理切片和结肠组织炎症因子检测表明，F-5-ASA组小鼠肠黏膜再生，炎性细胞浸润减少，IL-1β、IL-6及TNF-α促炎细胞因子表达下调，抑炎细胞因子IL-10显著上调。以上结果说明，膳食纤维联合5-ASA治疗具有协同效果，可在5-ASA治疗基础上进一步提升肠道黏膜屏障修复能力，调控细胞因子释放分泌，从而提升治疗效果。为评估膳食对小鼠肠道菌群的调控效果，笔者在本研究中对小鼠肠道菌群丰度和代谢途径进行测序分析。结果表明膳食纤维联合5-ASA治疗可改善小鼠肠道菌群多样性，调控特定肠道菌群在门和属水平丰度，并显著改变特征菌群代谢途径。

综上所述，膳食纤维联合5-ASA治疗UC可通过调控小鼠肠道菌群和改变菌群代谢途径，有效改善肠道炎症症状，调控炎性细胞因子分泌，达到良好的治疗效果。