徐静琳　韩颖敏　孔祥静　陶海英

[關键词] 糖尿病肾病;自噬;细胞凋亡;细胞增殖;上皮-间质转化

[中图分类号] R587.24          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）17-0029-05

Effect of overexpressed LncRNA H19 on the biological behavior of podocytes of patients with diabetic nephropathy and its related mechanism

XU Jinglin1   HAN Yingmin1   KONG Xiangjing1   TAO Haiying2

1.Department of Nephrology，the First People′s Hospital of Taizhou City in Zhejiang Province， Taizhou   318020， China; 2.Department of Endocrinology，the First People′s Hospital of Taizhou City in Zhejiang Province， Taizhou   318020， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of overexpressed lncRNA H19 on the biological behavior of podocytes in patients with diabetic nephropathy and its related mechanism. Methods Mouse podocyte cell line MPC5 was selected. After the incubation，they were divided into the normal group，high glucose group，silencing group and overexpression group，and the four groups of cells were intervened respectively. MTT assay was used to detect cell proliferation. TUNEL assay was used to detect cell apoptosis. Transwell chamber assay was used to detect cell invasion. The cell wound scratch assay was used to detect cell migration. RT-PCR was used to detect the expressions of lncRNA H19，E-cadherin and vimentin. Western blot was used to detect the relative expressions of apoptosis-related proteins PI3K，Akt，mTOR and autophagy-related proteins Beclin-1， PINK1， Parkin. Results At 24 h，48 h and 72 h，compared with the normal group， the other three groups showed higher rate of the cell proliferation and lower rate of apoptosis. Compared with the high glucose group and silencing group，the proliferation rate of cells in overexpression group was higher and the apoptosis rate was lower （P<0.05）. Compared with the normal group，the other three groups had higher invasion index and migration index in cells. Compared with the high glucose group and silencing group，the overexpression group exhibited lower invasion index and migration index in cells（P<0.05）. Compared with the normal group， the expression of E-cadherin in the other three groups was higher， the expression of lncRNA H19 and vimentin was lower，the relative expression of PI3K，Akt and mTOR was lower，and the relative expression of Beclin-1，PINK1 and Parkin was higher. Compared with the high glucose group and silencing group， the expression of E-cadherin in overexpression group was lower， the expression of LncRNA H19 and vimentin was higher，the relative expression of PI3K，Akt and mTOR was higher，and the relative expression of Beclin-1，PINK1 and Parkin was lower （P<0.05）. Conclusion Overexpressed lncRNA H19 can inhibit the apoptosis of podocytes and promote the proliferation， invasion and migration of podocytes in diabetic nephropathy. The mechanism of action may be that the overexpression of lncRNA H19 can target the regulation of the expressions of apoptosis-related proteins and autophagy-related proteins，thus playing a protective role in podocytes in diabetic nephropathy.

[Key words] Diabetic nephropathy; Autophagy; Cell apoptosis; Cell proliferation; Epithelial-mesenchymal transition

糖尿病肾病是一种临床常见的糖尿病慢性并发症，对患者身体健康、生活质量造成严重威胁[1-2]。我国人口老龄化现象不断发展，糖尿病发病率一直居高不下，每年新增糖尿病肾病患者也随之不断上升[3-4]。糖尿病肾病患者主要临床表现为肾功能损伤、蛋白尿。有研究表示，糖尿病肾病患者蛋白尿主要是由于足细胞损伤导致的[5-6]。糖尿病肾病临床治疗难度较高，若病情得不到及时有效的控制，可能会进一步发展为终末期肾病，对患者生命安全造成威胁[7-8]。但目前临床并无特效的糖尿病肾病治疗手段，因此寻找新的糖尿病肾病治疗靶点成为目前临床医学的研究热点。本研究设计高糖刺激小鼠足细胞系MPC5实验，靶向调控LncRNA H19表达，旨在探讨调控LncRNA H19表达对糖尿病肾病足细胞的保护作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

①研究细胞：小鼠足细胞系MPC5（上海弘顺生物科技有限公司）。②主要试剂：小鼠抗兔LncRNA H19抗体（Hyclone公司）;大鼠抗小鼠E-cadherin、vimentin抗体（Invitrogen公司）;小鼠抗大鼠Beclin-1抗体（Gibco公司）;大鼠抗兔PI3K、Akt抗体（BD公司）;大鼠抗小鼠mTOR抗体（Sigma公司）;兔抗小鼠PINK1、Parkin抗体（Selleck公司）。

1.2 细胞培养及分组处理

取冻存的MPC5细胞，40℃环境中火浴处理，充分摇晃均匀后将其置于2 mL培养基（100 g/L青霉素、链霉素及10%胎牛血清）内，进行离心处理，3000 r/min，重悬处理后进行细胞传代，将细胞培养基置于5%CO2培养箱中培养。将MPC5细胞分为正常组、高糖组、沉默组、过表达组。正常组细胞正常培养，不做其他处理;高糖组、沉默组、过表达组细胞在30 mmol/L葡萄糖培养基中刺激2 d，将各组细胞培养板置于37℃培养箱内培养，培养2周后使用培养基（含1%胎牛血清）培养1 d，重悬处理后分别加入4 μg生理盐水、pcDNA3.1-LncRNA H19、LncRNA H19-siRNA，电击后常温保存2 h，使用培养基培养72 h。

1.3 观察指标

1.3.1 细胞增殖、凋亡能力检测  ①MTT法检测细胞增殖：将各组细胞加入96孔板中，分别于24 h、48 h、72 h后于每孔中加入30 μL的MTT液，37℃孵育4 h，弃培养液，加入150 μL的DMSO，酶标仪在498波长处检测每孔的OD值。②TUNEL法检测细胞凋亡：常温下使用20 μg/mL蛋白酶K培养0.5 h后去除蛋白，清洗后加入100 μL平衡缓冲液，室内平衡10 min，滴入100 μL TdT酶反应液，避光、室温环境中孵育1 h后加入100 μLSSC溶液，静置20 min后清洗3次，DAPI复染，避光培养10 min后清洗、封片观察。DAPI复染细胞核呈蓝色，凋亡细胞细胞核呈绿色，取每切片3个视野进行观察、计算细胞凋亡率，计算平均值。

1.3.2 细胞侵袭、迁移能力检测  ①Transwell小室实验检测细胞侵袭：2 h前湿化小室。上室加入细胞悬液200 μL，在下室加入含10%胎牛血清的细胞培养液，在培养箱中培养24 h。用PBS冲洗2次后置于4%多聚甲醛中30 min，染色后放在显微镜下观察计数，计算侵袭指数。②细胞划痕实验检测细胞迁移：将细胞使用胰酶消化制成细胞悬液，接种于6孔板。使用10枪尖垂直于孔板底部画直线，PBS缓冲液清洗3次。常温培养24 h拍照计算迁移指数。

1.3.3 LncRNA H19、EMT相关基因表达检测  RT-PCR检测LncRNA H19、E-cadherin、vimentin表达。提取细胞总RNA，检测RNA纯度、含量，逆轉录处理后获得cDNA，使用Primer5.0软件设计引物，采用2-△△Ct方法计算，内参U6，采用2-△△Ct方法计算出需要检测的LncRNA H19、E-cadherin、vimentin表达量，LncRNA H19上游引物：5′-TTCAAAGCCTCCACGACTCT-3′，下游引物：5′-GCTCACACTGACGCACACTC-3′。E-cadherin上游引物：5′-ACAGGATGGCTGAAGGTGAC-3′，下游引物：5′-GGATGACA-CAGCGTGAGAGA-3′。vimentin上游引物：5′-GA-CCTCTACGAGGAGGAGAT-3′，下游引物：5′-TTGTCA-ACATCCTGTCTGAA-3′。反应体系：10 μL 2×All-in-One qPCR Mix、1 μL引物正义链、2 μL 50×Syner Green、2 μL cDNA、1 μL引物反义链、4 μL ddH2O;反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s，共进行30个循环。

1.3.4 细胞凋亡、自噬相关蛋白相对表达量检测  使用Western-blot法检测PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、PINK1、Parkin相对表达量。提取50 μg蛋白，煮沸5 min使蛋白变性后用SDS-PAGE凝胶电泳，然后依据蛋白分子大小将凝胶切开并转移至PVDF膜上，用Western封闭液把待测蛋白和内参蛋白封闭90 min在室内，按1∶1000加到待测蛋白抗体，内参抗体以1∶2000加入抗体，孵育过夜4℃，使用Western洗涤液洗涤5次，每10分钟 1次。按1∶5000加入稀释山羊抗兔IgG，孵育60 min室温水平摇床，洗涤5次Western洗涤液，每10分钟 1次。经过ECL显色和曝光后，进行BIO-RAD成像，使用Image J图像分析系统检测条带的灰度值，以内参条带灰度值与蛋白比值为结果统计分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验;组内不同时间点重复测量进行方差分析，组间对比行独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖率、凋亡率比较

24 h、48 h、72 h时，与正常组细胞比较，其他三组细胞增殖率较低，凋亡率较高，差异有统计学意义（P<0.05）;与高糖组、沉默组细胞比较，过表达组细胞增殖率较高、凋亡率较低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组细胞侵袭、迁移指数比较

与正常组细胞比较，其他三组细胞侵袭指数、迁移指数较高，差异有统计学意义（P<0.05）;与高糖组、沉默组细胞比较，过表达组细胞侵袭指数、迁移指数较低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 各组细胞LncRNA H19、EMT相关基因表达比较

与正常组细胞比较，其他三组细胞E-cadherin表达较高，LncRNA H19、vimentin表达较低，差异有统计学意义（P<0.05）;与高糖组、沉默组细胞比较，过表达组细胞E-cadherin表达较低，LncRNA H19、vimentin表达较高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 各组细胞PI3K/Akt通路蛋白相对表达量比较

与正常组细胞比较，其他三组细胞PI3K、Akt、mTOR相对表达量较低，差异有统计学意义（P<0.05）;与高糖组、沉默组细胞比较，过表达组细胞PI3K、Akt、mTOR相对表达量较高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4、图1。

2.5 各组细胞自噬相关蛋白相对表达量比较

与正常组细胞比较，其他三组细胞Beclin-1、PINK1、Parkin相对表达量较高，差异有统计学意义（P<0.05）;与高糖组、沉默组细胞比较，过表达组细胞Beclin-1、PINK1、Parkin相对表达量较低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表5、图2。

3 讨论

随着糖尿病症状的发展，会出现一系列的并发症，其中糖尿病肾病是一种较为常见、严重程度较高的慢性糖尿病并发症[9-10]。糖尿病肾病患者多表现为慢性高血糖、蛋白尿，具有严重程度高、病死率高等特点，随着糖尿病肾病症状的不断发展，患者出现代谢紊乱，严重的会发展成为终末期肾病，对患者预后造成严重威胁[11-12]。近年来我国糖尿病肾病发病率一直居高不下，且目前尚无一种特效的治疗糖尿病肾病的方法，因此越来越多的专家学者开始通过基础医学、分子生物学等途径对糖尿病肾病发病机制、治疗靶点进行研究[13-14]。

长链非编码RNA（LncRNA）是一种内源性RNA，在细胞损伤、凋亡以及多种疾病的发生发展过程中发挥重要作用[15-16]。大量实验研究表明，LncRNA参与糖尿病肾病的发生发展过程，LncRNA H19是长链非编码RNA家族的重要组成成员。大量研究表明，LncRNA H19表达异常变化参与恶性肿瘤的发生演进，但关于LncRNA H19在糖尿病肾病中作用的研究还鲜有报道[17-18]。有研究表明，随着糖尿病肾病的发生发展，足细胞会出现一定程度的损伤、凋亡、坏死。有研究表明，LncRNA H19表达与机体慢性肾脏病发生发展具有一定联系，但关于LncRNA H19表达与糖尿病肾病足细胞损伤的相关性还鲜有报道[19]。本研究结果显示，高糖刺激后的足细胞增殖率下降、凋亡率、侵袭、迁移指数上升，进行过表达LncRNA H19干预的细胞增殖率上升、凋亡率、侵袭、迁移指数下降，提示糖尿病肾病的发展伴随着足细胞损伤，过表达LncRNA H19能够促进足细胞增殖，抑制足细胞凋亡、迁移，从而起到糖尿病肾病足细胞保护作用。

糖尿病肾病患者主要临床表现为蛋白尿，糖尿病肾病蛋白尿主要是由于足细胞损伤导致的[20]。有研究表示，糖尿病肾病发生发展伴随着上皮间质转化（EMT），EMT的发生导致足细胞结构及功能均受到一定程度的损伤，进而导致蛋白尿的发生，因此抑制EMT是减轻糖尿病肾病患者蛋白尿表现的关键。E-cadherin、vimentin是较为常用的EMT基因，二者表达变化与EMT密切相关。本研究结果显示，过表达LncRNA H19干预的足细胞E-cadherin表达下降，vimentin表达上升，提示过表达LncRNA H19能够靶向调控E-cadherin、vimentin表达，逆转EMT发生，从而起到减轻糖尿病肾病足细胞损伤的作用。

细胞损伤的发生发展与细胞凋亡、自噬能力具有密切联系[21-22]。PI3K/Akt信号通路相关蛋白P13K、Akt、mTOR蛋白表达变化与细胞凋亡能力密切相关，靶向调控PI3K/Akt信号通路蛋白表达，能够对细胞增殖、凋亡能力進行干预。细胞自噬与细胞损伤、凋亡有密切联系，PINK1/Parkin通路蛋白表达变化与细胞线粒体自噬具有密切联系，Beclin-1、PINK1、Parkin是细胞自噬标志物，常用于细胞自噬情况的检测。本研究结果显示，过表达LncRNA H19干预的足细胞P13K、Akt、mTOR、Beclin-1、PINK1、Parkin表达受到明显调控，提示过表达LncRNA H19能够靶向调控PI3K/Akt通路、PINK1/Parkin通路蛋白，抑制糖尿病肾病足细胞自噬、凋亡，从而对糖尿病肾病足细胞起到一定的保护作用。

综上所述，过表达LncRNA H19表达能够抑制糖尿病肾病足细胞凋亡，促进糖尿病肾病足细胞增殖、侵袭、迁移，其作用机制可能为过表达LncRNA H19能够靶向调控细胞凋亡相关蛋白及细胞自噬相关蛋白表达，从而对糖尿病肾病足细胞起到保护作用，为糖尿病肾病的临床治疗提供新的研究靶点及理论依据。

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（收稿日期：2020-12-04）