吴琦

[关键词] 三叶青黄酮;STAT3信号通路;膀胱癌;细胞增殖;细胞凋亡

[中图分类号] R735.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）17-0025-04

Effect and mechanism research of cloverleaf flavonoids regulated STAT3 signaling pathway on proliferation and apoptosis of bladder cancer cells

WU Qi

Department of Urinary Surgery， the People's Hospital of Lishui City in Zhejiang Province， Lishui   323000， China

[Abstract] Objective To analyze the effect and mechanism of cloverleaf flavonoids regulated STAT3 signaling pathway on the proliferation and apoptosis of bladder cancer cells. Methods Bladder cancer T24 cells were divided into the control group，the low-dose group and the high-dose group，and treated with the blank medium，50 μg/mL cloverleaf flavonoids and 100 μg/mL cloverleaf flavonoids， respectively. Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis， and MTT method was used to detect the apoptosis inhibition rates of T24 cells. The levels of Caspase-3， Caspase-9， Bax， Bcl-2， STAT3 and β-actin were detected by Western blot. Results The inhibitory rate of cell proliferation of bladder cancer cells in the high-dose group was significantly higher than that in the low-dose group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The apoptosis rates of bladder cancer cells in the control group， the low-dose group and the high-dose group were significantly different， and the apoptosis rate in the high-dose group was the highest， and the differences were statistically significant（P<0.05）. The expression levels of Caspase-3， Caspase-9， Bax， Bcl-2 and STAT3 were significantly different among all groups， and the expression levels of Caspase-3， Caspase-9 and Bax were the highest in the high-dose group， while the levels of Bcl-2 and STAT3 were the lowest， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Cloverleaf flavonoids regulate STAT3 signaling pathway to inhibit proliferation and promote apoptosis of bladder cancer cells.

[Key words] Cloverleaf flavonoids; STAT3 signaling pathway; Bladder cancer; Cell proliferation; Cell apoptosis

膀胱癌是現阶段临床中较为常见的尿路上皮系统恶性肿瘤，一般情况下患者术后极易复发，且多种药物治疗效果和预防方案均不理想，并具有一定的毒副作用[1]。三叶青（Lespedeza buergeri miq）具有祛风化痰、清热解毒、活血止痛功效，临床中多用于对肺炎、小儿高热惊厥等症状进行治疗，且现也多用于对各类肿瘤进行治疗[2]。有学者采用三叶青对肿瘤患者进行治疗，可有效延缓患者生命，抑制肿瘤生长，改善患者生命征象等[3]。虽然三叶青是临床常用药，但其药理相关研究还有待进一步分析和完善[4]。大量研究结果显示，生物类黄酮多具有明确的抗肿瘤效果，因而对三叶青的成分进行鉴定和分析具有十分重要的意义[5]。前期对三叶青成分分离和鉴定分析发现三叶青富含黄酮[6]，为进一步探讨三叶青在膀胱癌中的应用效果，本研究利用三叶青黄酮对膀胱癌细胞进行干预，分析三叶青黄酮调控STAT3信号通路对膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 三叶青黄酮制备

取1000 g三叶青块根，利用碱性稀醇提取法提取三叶青黄酮7.6 g，后利用聚酰胺层析后分别利用不同浓度（10%、30%、50%、70%、95%）乙醇洗脱，真空干燥后称重，分别标记HT10、HT30、HT50、HT70、HT95并合并样品分别取2 mg，使用200 μLDMSO溶解，震荡全部溶解后，加入1640培养基（800 μL）中，调整浓缩液浓度为20 mg/mL，置于4℃冰箱中保存。

1.2 细胞培养及分组

本研究所用人膀胱癌T24细胞购自上海细胞生物学研究所，T24细胞使用RPMI 1640完全培养基，置于37℃、CO2培养箱中进行培养，细胞达对数生长期后进行传代培养，且将细胞分为空白组、低浓度组（50 μg/mL）、高浓度组（100 μg/mL）。

1.3 方法

将细胞依照分组分别使用空白培养基、50 μg/mL三叶青黄酮、100 μg/mL三叶青黄酮对各组细胞进行干预。干预48 h后收集各组细胞并调整细胞终浓度至1×106个/mL，吸取细胞加入Annexin V/FITC（上海前尘生物科技，40302ES20）5 μL和20 μg/mL碘化丙啶（艾美捷科技，4830-250-03）10 μL，室温避光孵育15 min，加入400 μL磷酸盐缓冲溶液，后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。将细胞悬液接种于96孔板，加入15 μL噻唑蓝（苏州海恒生物医药，298-93-1）溶液，孵育4 h后弃上清液，加入150 μL二甲基亚砜，震荡10 min后使用562 nm波长进行检测，测定光密度，计算各组三叶青黄酮对T24细胞的抑制率。干预48 h后收集各组细胞，加入RIPA裂解液（碧云天生物科技，P0013B）冰上处理5 min，后使用超声匀浆提取总蛋白，使用10% SDS-PAGE电泳分离后并转至PVDF膜，使用牛血清白蛋白（湖北麦凯斯精化科技，9048-46-8）封閉1 h，分别加入Caspase-3（CST，9662S）、Caspase-9（CST，9502S）、Bax（CST，14796S）、Bcl-2（CST，2807S）、STAT3（CST，9139S）、β-actin（CST，4970L）一抗抗体，4℃孵育过夜，TBST清洗3次后室温孵育辣根过氧化物酶标记二抗1 h，TBST冲洗3次，后使用ECL试剂盒检测显影。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，使用flowjo软件分析流式细胞术检测使用，采用ImageJ分析Western-blot检测结果，以α=0.05作为检验标准。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高剂量组和低剂量组细胞增殖抑制率情况比较

高剂量组的膀胱癌细胞细胞增殖抑制率为（73.28±14.61）%，明显高于低剂量组的（23.52±8.08）%，差异有统计学意义（t=22.395，P<0.05）。

2.2 各组细胞凋亡率比较

对照组膀胱癌细胞凋亡率为（1.21±0.23）%、低剂量组为（11.35±0.94）%、高剂量组为（26.48±1.05）%，高剂量组中细胞凋亡率最高，差异有统计学意义（F=13.021，P<0.05）。

2.3 各组细胞蛋白表达水平比较

对照组、低剂量组、高剂量组膀胱癌细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、STAT3表达水平有明显差异，其中高剂量组细胞Caspase-3、Caspase-9、Bax表达水平最高，Bcl-2、STAT3水平最低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1、图1。

3 讨论

膀胱癌是发生在膀胱黏膜的泌尿系统常见恶性肿瘤，也是目前临床中最为常见的恶性肿瘤之一[7]。有研究指出，膀胱癌的临床发病率占我国泌尿生殖系肿瘤第1位[8]。任何年龄均可能发生膀胱癌，随着年龄增长患者发病率也呈现增加趋势，膀胱癌病理类型包括膀胱鳞状细胞癌、膀胱尿路上皮癌、膀胱腺癌，还包括膀胱小细胞癌、膀胱透明细胞癌、膀胱类癌等罕见病理类型[9]。一般情况下，膀胱癌病因复杂，既有外在环境因素也有遗传因素，职业接触芳香胺、吸烟是明确的致病危险因素[10]。90%以上膀胱癌患者最为显著的临床表现是血尿，常表现间歇性、无痛性、肉眼全程血尿，有时也表现为镜下血尿，血尿可仅出现1次或持续数天等，也可自行停止或减轻[11]。患者血尿自止与服药等巧合的出现可能给患者造成病愈错觉。目前临床多采用手术或化疗方案对膀胱癌患者进行治疗，但其临床疗效仍有待进一步改善和提高[12]。

黄酮是三叶青中主要有效成分，不仅对炎症有良好的治疗效果，对肿瘤细胞具有一定的抑制作用[13]。现研究多集中于三叶青黄酮对乳腺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞的抑制作用，且研究显示三叶青黄酮主要通过调控基质蛋白蛋白酶水平抑制肿瘤增殖，促进其凋亡[14]。但其对膀胱癌的作用活性仍有待进一步分析研究，因此本研究利用冷凝回流法对三叶青中黄酮进行提取，并通过检测其生物学活性结果显示，三叶青黄酮可有效抑制膀胱癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。

Caspase-3和Caspase-9在细胞凋亡过程中扮演重要角色，也是关键的细胞凋亡执行分子，细胞内多种凋亡信号均可激活体内Caspase-3和Caspase-9细胞凋亡功能[15]。检测细胞中Caspase-3和Caspase-9可反映细胞中Caspase-3和Caspase-9影响活化水平，以了解并分析细胞凋亡状态[16]。肿瘤细胞会合成并分泌大量免疫抑制分子，影响肿瘤的发生发展。STAT3是最为重要的STATs 家族成员，属于核转录因子，参与调控细胞凋亡、增殖、分化等信号转导通路，STAT3异常活化会参与包括肺癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤的发生和发展，是最为常见的癌基因之一，阻断STAT3可作为治疗肿瘤的新靶点[17]。本研究结果显示，使用高剂量三叶青黄酮对膀胱癌细胞干预后可有效增强膀胱癌细胞的增殖抑制率，并可有效提高肿瘤细胞凋亡率。进一步分析发现，使用三叶青黄酮对T24细胞干预后可有效提高Caspase-3、Caspase-9、Bax水平，有效降低Bcl-2和STAT3水平。分析认为，三叶青黄酮可有效调节并改善T24细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax并抑制Bcl-2和STAT3水平，三叶青黄酮可有效激活膀胱癌细胞凋亡通路，促进细胞凋亡，其可能与三叶青黄酮可调控和抑制STAT3表达，进而引起细胞凋亡信号通路出现级联反应密切相关[18]。有学者指出，在膀胱癌患者病变组织中，Caspase-3和Caspase-9处于抑制状态，STAT3处于高表达状态[19]。通过本研究分析认为，三叶青黄酮干预后可有效提高肿瘤细胞中Caspase-3和Caspase-9水平并显著抑制STAT3的表达，其可能与三叶青黄酮可激活体内细胞凋亡途径而改变主要的凋亡标志蛋白水平，故在临床中膀胱癌患者可采用三叶青黄酮辅助治疗，有助于辅助提高常规化疗的临床疗效，提高患者治疗质量并改善患者预后质量。

综上所述，三叶青黄酮调控STAT3信号通路抑制膀胱癌细胞增殖并促进其凋亡。但并未深入分析其基因水平改变及分子生物学机制，有待后续深入研究并分析。

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（收稿日期：2020-12-30）