马静 张楠 马斌林

甲状腺癌在全世界的发病率迅猛上升，甲状腺乳头状癌是其中占比最多的病理类型。甲状腺乳头状癌缺乏特征性的术前检测标志物。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类非编码单链小RNA分子，在多种人类疾病，包括癌症中都表现出了功能异常或者表达异常[1]。miRNA-451位于17号染色体着丝粒附近，现有多项研究提示，miRNA-451在甲状腺乳头状癌组织中呈现低表达，且其表达的下调与甲状腺乳头状癌的发生有关。但是关于血清miRNA-451与甲状腺乳头状癌的关联研究并不多见。本研究采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测了36例甲状腺乳头状癌病人血清中miRNA-451的表达情况，分析了其表达与病人临床病理特征之间的关系，意在了解检测血清miRNA-451是否对甲状腺乳头状癌的术前诊断有帮助。

对象与方法

一、对象

2019年4～ 5月在我院接受手术治疗并且病理诊断明确的甲状腺肿瘤病人73例为研究对象(术前抽取血清备用)。其中36例为甲状腺乳头状癌病人，37例为甲状腺良性肿瘤。36例甲状腺乳头状癌病人中，男性7例，女性29例；平均年龄为(49.47±8.24)岁，其中≤55岁10例，>55岁26例；病灶位于单侧的30例，双侧6例；单个病灶25例，多个病灶11例；无淋巴结转移18例，有淋巴结转移18例。

二、方法

1.材料：36例甲状腺乳头状癌和37例甲状腺良性肿瘤病人的血清样本。

2.步骤：MiRcute Serum/Plasma miRNA Isolation Kit提取血浆总 RNA，采用反转录试剂miRNA First Strand cDNA Synthesis反转录获得 cDNA。采用qRT-PCR 仪对 miR-451进行扩增。反应体系：正、反引物(10 μmol/l)各0.5 μl，聚合酶和绿色荧光染料的预混液5.0 μl，cDNA(50 ng/μl)1.0 μl，RT-PCR试剂盒中水3.0 μl，共10 μl。反应条件设置如下：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。反应结束后，以miR-39为外参，采用 2-△△Ct法对miR-451a在不同血浆样品中的相对表达量进行分析。

三、统计学方法

结果

1.甲状腺乳头状癌及良性肿瘤病人血清微小RNA-451的表达情况：对甲状腺乳头状癌和甲状腺良性肿瘤病人的血清微小RNA-451表达量进行分析显示，两组血清微小RNA-451表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)；甲状腺乳头状癌病人血清中微小RNA-451表达量水平为(1.09±0.27)，良性肿瘤病人血清中微小RNA-451表达量水平为(1.31±0.23)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 血清miR-451在甲状腺乳头状癌与良性肿瘤病人中的相对表达水平对比

2.甲状腺乳头状癌病人血清微小RNA-451与临床病理特征的关系：血清微小RNA-451的表达水平与甲状腺乳头状癌病人临床病理特征之间的关系：血清微小RNA-451的表达水平在有淋巴结转移的病人中明显低于无淋巴结转移的病人(0.92±0.17 vs 1.28±0.22，P<0.05)，见表1。血清微小RNA-451的表达水平与甲状腺乳头状癌病人的年龄、性别、病灶位置、病灶数目等临床病理资料无关。

3.检测血清miRNA-451对甲状腺乳头状癌的临床诊断价值：以甲状腺良性肿瘤病人血清中miRNA-451表达量作为对照，制作受试者工作特征曲线(ROC曲线)，通过ROC曲线分析，血清微小RNA-451对诊断甲状腺乳头状癌的ROC曲线下面积(AUC)为0.720(图2)；在36例甲状腺乳头状癌病人中，以淋巴结未转移病人血清中的miRNA-451表达量作为对照，血清微小RNA-451对于判断甲状腺乳头状癌是否伴有淋巴结转移的ROC曲线下面积是0.873(图3)。

图2 血清miR-451在甲状腺乳头状癌与良性肿瘤病人中的相对表达水平的ROC曲线

图3 血清miR-451在甲状腺乳头状癌有无淋巴结转移病人中相对表达水平的ROC曲线

讨论

甲状腺肿瘤的术前诊断主要依赖于超声检查，依据目前超声诊断甲状腺结节的TI-RADS分级诊断系统，其对4级以上结节的恶性可能性评估范围跨度较大(5%～100%)[2]。甲状腺乳头状癌是甲状腺癌最常见的病理类型，其术前诊断的“金标准”是超声引导下的细针穿刺细胞学检查。但是细针穿刺细胞学的漏诊因素较多，例如甲状腺结节的大小、部位、距体表的距离及伴发的基础疾病等[3]，且细针穿刺细胞学检查属于有创检查，病人的配合度不尽相同。因此，甲状腺乳头状癌的术前诊断缺乏特异性的无创检测标志物。

miRNAs是细胞增殖、分化、凋亡和迁移的关键调控因子。miRNAs的异常表达与多种肿瘤的发生发展有关，包括不同类型的甲状腺癌[4]，在已知的miRNA中，有的miRNA在甲状腺癌组织中表现为下调，另一些表现为上调[5-6]。目前关于miRNAs与甲状腺癌的研究多集中于病理组织标本，关于甲状腺乳头状癌血清miRNAs检测的研究并不多见，少数研究者对miRNA-221、miRNA-222、miRNA-455在甲状腺乳头状癌病人血清检测的意义做了研究[7]。

miRNA-451位于17号染色体着丝粒附近，现有的研究提示其在多种恶性肿瘤中呈低表达，如在肝癌，胃癌的体外研究提示miRNA-451的表达与这些肿瘤的侵袭性呈负相关[8-9]。目前关于miRNA-451在甲状腺癌病理组织中的研究亦很多见，如Duan等[10]、Zhang等[11]检测了miRNA-451在甲状腺乳头状癌石蜡包埋组织中的表达，均发现其在甲状腺乳头状癌组织中的表达较癌旁组织明显为低，且后者的研究提示miRNA-451在淋巴结转移病人中的表达较无转移者低。李晓娜等[12]的研究也提示在甲状腺癌组织中miRNA-451表达显著低于癌旁组织，并分析了miRNA-451可通过靶向MIF抑制PI3K/Akt信号通路抑制K1甲状腺癌细胞增殖及促进细胞凋亡的机制。

基于以上miRNA-451在甲状腺癌病理组织中研究，本研究检测了36例甲状腺乳头状癌病人和37例甲状腺良性肿瘤病人的血清中miRNA-451的表达情况，意在通过检测甲状腺乳头状癌病人血清中miRNA-451的表达，了解其是否可以在术前对甲状腺乳头状癌的无创诊断提供帮助。本研究结果提示甲状腺乳头状癌病人血清中miRNA-451的相对表达量明显低于甲状腺良性肿瘤病人的表达，并且在比较了miRNA-451与甲状腺乳头状癌病人临床病理资料的关系时发现miRNA-451在有淋巴结转移病人中的表达量更低，这与上述研究者在甲状腺乳头状癌石蜡包埋组织中的检测结果一致；通过受试者工作曲线分析了血清miRNA-451对诊断甲状腺乳头状癌的ROC曲线下面积(AUC)为0.720，表明检测血清miRNA-451有助于区分甲状腺疾病的良恶性，但是其诊断效能并不很理想；基于本研究中miRNA-451在甲状腺乳头状癌有淋巴结转移病人中的表达明显低于其在无淋巴结转移病人中的表达的实验结果，我们分析了血清miRNA-451在判断甲状腺乳头状癌有否淋巴结转移的ROC曲线下面积是0.873，说明检测血清miRNA-451对于术前判断甲状腺乳头状癌病人淋巴结是否转移有一定的诊断意义。

目前关于miRNA-451与甲状腺乳头状癌关系的研究尚处于初步阶段，虽然本研究提示甲状腺乳头状癌病人的血清miRNA-451呈低表达，但仍需扩大样本量进一步分析，并进一步探索血清中miRNA-451表达是否与组织标本中的表达完全一致，进而从机制上了解miRNA-451如何影响甲状腺乳头状癌的发生发展。在目前甲状腺癌仍然基于超声及术前细胞学穿刺作为手术依据的情况之下，探索血清miRNA-451在诊断甲状腺乳头状癌病人的表达节点，并在术前对淋巴结是否有转移做出预判有一定的研究意义，期待miRNA-451血清检测能够为甲状腺乳头状癌病人的术前诊断及淋巴结预判提供一种无创的检测方法。