王 斌，张 娜,冯 航，王晨骁，吴 克，杨增岐 (西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)又称魏氏梭菌，是能够引发人和多种动物疾病的人兽共患病原菌，为条件致病菌，严重威胁动物健康和人类公共卫生安全[1]。产气荚膜梭菌致病性强，可引起畜禽肠毒血症、人畜食物中毒、家畜猝疽等多种病症。目前，该菌发现的外毒素有α、β、ɛ、、γ、η、δ、θ、κ、λ、μ 和 ν等十余种，起主要致病作用的毒素有α、β、ɛ、[2]。根据这些毒素与抗毒素的中和试验，分为A、B、C、D、E 5个型。近年来，随着养殖规模的增大，产气荚膜梭菌的流行日渐广泛，黄牛、奶牛、绵羊、山羊、猪、鸡、兔等发病报道逐渐增多，关于野生动物产气荚膜梭菌病的报道也逐渐增多[3-4]。

朱鹮(Nipponia nippon)属鹤形目，鹤科，朱鹮属，与大熊猫、金丝猴、羚牛并称为四大国宝，以其稀少和外形美丽而闻名于世，是我国一级保护野生动物，世界一级濒危物种[5]。截止目前，尚未见朱鹮因感染产气荚膜梭菌而发病死亡的报道，本研究从病死的朱鹮肠内容物及肝脏中分离到3株革兰阳性杆菌，经生物学特性研究、生化试验及分子生物学试验鉴定为A型产气荚膜梭菌，动物致病性试验表明分离的A型产气荚膜梭菌能够引起SPF鸡特征性病理变化，证实所分离的产气荚膜梭菌为引起朱鹮感染死亡的病原菌。

1 材料与方法

1.1 病料陕西省两自然保护区的数只朱鹮出现腹泻死亡，剖检可见肠道广泛性出血，肝脏肿大质脆色暗，无菌采样后分别运送死亡朱鹮小肠2份和肝脏1份至本实验室。

1.2 实验动物12只SPF鸡购自济南斯帕法斯家禽有限公司。

1.3 试验试剂及培养基5%绵羊血-1%葡萄糖琼脂、厌氧肉肝汤、革兰染色液、石蕊牛乳、卵磷脂培养基，均参照文献[6]配制；药敏纸片购自杨凌俊扬生物科技有限公司；细菌DNA提取试剂盒和部分生化试验管购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；2×Taq PCR Master Mix和DL2000 DNA Marker购自Genstar；琼脂糖、琼脂、营养琼脂等均为国产试剂。

1.4 引物的设计与合成16S rRNA引物由西安擎科泽西生物技术有限公司合成；针对魏氏梭菌主要毒素基因序列，参考公开发表的引物序列合成引物(表1,2)[7]。

表1 16S rRNA引物信息

1.5 细菌的分离培养无菌采集死亡朱鹮的肝脏和小肠内容物，制成组织抹片后革兰染色镜检，同时分别取小块肝脏和肠内容物放入无菌离心管中，80℃水浴15 min，离心取上清加至厌氧肉肝汤中37℃培养18～24 h，离心，用接种环蘸取沉淀接种至5%绵羊血-1%葡萄糖琼脂培养基37℃厌氧培养36 h，观察菌落形态。

1.6 生化试验将分离的可疑纯培养物接种于牛乳培养基中，37℃培养24 h，观察记录生化反应结果。

1.7 分子生物学试验

1.7.1细菌16S rRNA PCR检测 将纯化的细菌接种于10 mL的厌氧肉肝汤，37℃培养12 h，取5 mL 菌液12 000 r/min离心1 min后，根据细菌DNA提取试剂盒操作步骤提取DNA。PCR反应体系:2×Taq PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，细菌DNA 2 μL，无菌双蒸水补至总体积20 μL。反应程序：94℃ 5 min,94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 5 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并送至西安擎科生物有限公司测序。

1.7.2多重PCR鉴定毒素类型 以1.7.1提取的细菌DNA为PCR模板，引物的浓度分别为Cpa:10 μmol/L，Cpb、Ext、Ia20 μmol/L；PCR反应体系：2×Taq PCR Master MiX 16 μL，不同浓度Cpa、Cpb、Ext、Ia的上、下游引物各1 μL，细菌DNA 2 μL，灭菌双蒸水补至总体积为50 μL。PCR反应条件：94℃ 10 min；94℃ 30 s，51.6℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统下观察条带，同时PCR产物送至西安擎科生物有限公司测序。

1.8 动物致病性试验将12只21日龄SPF鸡每组3只随机分为4组，其中2～4组为试验组，1组为对照组。3株分离菌株分别使用无菌生理盐水稀释至1.5×108CFU/mL，试验组SPF鸡腹腔分别注射各菌株菌液0.5 mL，对照组腹腔注射0.5 mL无菌生理盐水。

1.9 分离菌的药敏试验将分离菌株用无菌生理盐水稀释至0.5麦氏值，用无菌棉签将菌液均匀涂布至5%绵羊血-1%葡萄糖琼脂培养基上，贴附药敏片后,置37℃培养箱中厌氧培养24～48 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，参考美国临床实验室标准化委员会颁布的《抗微生物药物敏感性实验执行标准》判定药敏试验结果。

2 结果

2.1 细菌分离培养

2.1.1镜检结果 3只病死朱鹮肠及肝脏抹片，革兰染色镜检均可见革兰阳性，散在或成对存在有荚膜的杆菌，菌体两端钝圆[8]，基本无链状排列(图1)。

2.1.2菌落形态观察 将朱鹮组织加入厌氧肉肝汤培养5 h后，肉肝汤变浑浊且不断有气泡产生。将培养18 h后的肉肝汤培养物接种到葡萄糖血琼脂37℃厌氧培养36 h后，血平板上可见大小为2～4 mm，灰白色，圆形，边缘整齐[9]，表面光滑半透明呈圆屋顶状的菌落，菌落周围呈现双溶血环，在空气中暴露一段时间后菌落变为淡绿色(图2)。

2.2 生化试验结果通过菌落特征和染色镜检，以及生化试验结果与《伯杰细菌手册》对比发现，分离菌株与产气荚膜梭菌高度相似(表3)。

表3 3株产气荚膜梭菌的生化鉴定结果

2.3 细菌16S rRNA PCR鉴定对3株分离株的16S rRNA基因进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系统中可见约1 300 bp大小的条带(图3)。登录NCBI网站将测得的16S rRNA基因序列与GenBank数据库进行同源性检索，结果表明同源性达98%以上，确定为产气荚膜梭菌。

M.DL2000 DNA Marker;1.Cp1;2.Cp2;3.Cp3;4.阴性对照图3 16S rRNA的PCR鉴定结果

2.4 毒素基因型鉴定经多重PCR对3株分离株毒素分型结果显示，3株均仅扩增出1条约325 bp 大小的α毒素条带(图4)，表明3株分离株均为A型产气荚膜梭菌。

M.DL2000 DNA Marker;1.Cp1;2.Cp2; 3.Cp3;4.D型魏氏梭菌阳性对照菌株图4 产气荚膜杆菌分离株多重PCR扩增结果

2.5 动物致病性试验3组试验组SPF鸡于攻毒后4 h陆续出现精神萎靡，食欲、饮欲减退，呆立不动等症状，6 h后陆续死亡，对照组SPF鸡未见异常。剖解病死鸡可见肠道鼓气，肠壁变薄，肠道黏膜出血性坏死，呈坏死性肠炎肝脏色泽变黑易碎。无菌采集肠道及肝脏等组织制备抹片，革兰染色镜检可见革兰阳性，有荚膜，散在或成对存在杆菌，病变肠道和肝脏经细菌分离鉴定获得产气荚膜梭菌。

2.6 药敏试验结果药敏试验结果表明，3株分离菌对青霉素、氨苄西林、头孢噻呋、万古霉素、氧氟沙星、四环素抗菌药敏感，对丁胺卡那、新霉素完全耐药，对红霉素、麦迪霉素、克林霉素、庆大霉素、复方新诺明出现不同程度的耐药(表4)。

表4 分离菌Cp1、Cp2、Cp3药敏试验结果

3 讨论

产气荚膜梭菌为条件致病菌，可正常存在于动物肠道[10]，当肠道内容物酸碱度和氧饱和度等内环境因素改变时，会导致产气荚膜梭菌的大量增殖而引起发病，其中气候骤变、高蛋白饮食、饲料更换等为常见诱因[11]，在动物日常饲养管理中应加以重视。

本试验从朱鹮组织脏器分离3株产气荚膜梭菌均为含α毒素的A型菌株，动物致病性试验表明α毒素具有极强的致病性，证实所分离的A型产气荚膜梭菌为引起3只朱鹮死亡的病原菌。药物敏感性试验结果表明，3株分离菌对丁胺卡那、新霉素完全耐药，对红霉素、克林霉素、庆大霉素呈现出不同程度的耐药，其中Cp1和Cp2有多重耐药特点，应根据药敏试验结果合理使用抗生素进行治疗，同时应引起对野生动物源细菌耐药性的重视。

本研究系对朱鹮产气荚膜梭菌感染引发死亡的首次报道，以期引起对野生动物产气荚膜梭菌感染致死以及野生动物源细菌耐药性的关注，试验中涉及的细菌分离鉴定、毒素分型、药物敏感性试验等方法，均能够对野生动物产气荚膜梭菌的理论研究和综合防治提供重要参考。