吕茂杰,王显兵，孙 晨，3，张 英，车艳杰*，丁 壮，鲍恩东,3* (1.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 13006；.天津瑞普生物技术股份有限公司 生物制品研究院，天津 300308；3.南京农业大学 动物医学院，江苏 南京 10095)

猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)[1]的主要病原，该病主要表现为体质量下降、呼吸困难、黄疸以及间质性肺炎、淋巴结肿大、肝炎和肾炎等症状[2]。PCV2主要感染断奶仔猪和育肥猪，自1991年在加拿大发生后，迅速蔓延到各养猪国家，成为目前危害世界养猪业的重要疫病之一[3]。猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是猪支原体肺炎(Mycoplasmalpneumoniaof swine，MPS)(又称猪气喘病，也称地方性肺炎)的主要病原。该病的主要特点为传染性高、发病率高和死亡率低，主要表现为发热、咳嗽、呼吸困难等症状，造成食欲减退、生长阻滞、饲料转化率降低及上市时间延迟[4-5]。副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)引起的猪多发性浆膜炎和关节炎，主要临床症状为发热、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行、共济失调和被毛粗乱等；剖检病理变化表现为胸膜炎、肺炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等[6-9]。此外，HPS还可引起败血症，并且可留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。HPS的血清型复杂多样，按琼脂扩散血清分型方法，至少可分为15种血清型，另有20%以上的分离株不可定型，目前我国以4，5型最为流行，其次为12，13，14型，而其他血清型均较少[10-11]。

PCV2感染猪后破坏其免疫系统，产生免疫抑制，增加了猪对多种病原体的易感性，易与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)和HPS、猪链球菌等混合感染，引发难以控制的严重疾病[12-17]。Mhp很容易引起猪群继发感染其他疾病，常与猪流感病毒(SIV)、PRRSV、PRV和PCV2等病毒性疾病和巴氏杆菌病、胸膜肺炎、链球菌病和副猪嗜血杆菌病等细菌性疾病混合感染，形成猪呼吸系统疾病综合征(porcine respiration disease complex，PRDC)[18]。HPS已成为我国各猪场保育仔猪死亡的一个主要原因，一些免疫抑制性的病毒，如PRRSV、PCV等经常与该菌混合感染[19]，疫苗接种己成为预防和控制该病的主要措施[20-21]。

鉴于3种病原混合感染的普遍性，目前在临床实际生产中使用的疫苗多为单价疫苗或二联苗，对于3种抗原的三联疫苗的使用尚未见报道。本研究通过将PCV2杆状病毒载体表达的Cap蛋白抗原、Mhp抗原和HPS 4，5型抗原按照一定比例混合，加入适宜佐剂制备PCV2、Mhp、HPS三联灭活疫苗，通过对免疫仔猪的安全性、抗体水平和攻毒保护效果的评价，表明该三联疫苗的安全性和有效性良好，为实现“一针三防”奠定基础。

1 材料与方法

1.1 抗原PCV2 Cap蛋白，由PCV2 RPVS0301株ORF2基因经密码子优化的重组杆状病毒RP-1株接种Sf9细胞制得，经浓缩纯化后质量浓度为200 mg/L，批号P1901；Mhp灭活抗原，质量浓度为3 g/L，批号M1901；HPS 4型RPBS0904-11株灭活抗原(含灭活前活菌数≥1.0×1010CFU/mL)和HPS 5型RPBS0905-3株灭活抗原(含灭活前活菌数≥1.0×1010CFU/mL)，批号为H41901和H51901，均由天津瑞普生物技术股份有限公司生物制品研究院制备和提供。

1.2 主要试剂Montanide IMS 1313 VG NST，批号：171115017195，购自法国SEPPIC公司；硫柳汞钠购自国药集团化学试剂有限公司；PCV2 Cap蛋白单克隆抗体购自浙江大垚生物科技有限公司；Mhp兔源阳性血清，琼扩效价≥1∶16，由天津瑞普生物技术股份有限公司制备；HPS 4，5型兔源阳性血清，抗体效价≥1∶128；SDS-PAGE试剂购自北京索莱宝科技有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠IgG，HRP标记山羊抗兔IgG，HRP标记山羊抗猪IgG购自KPL公司；DAB显色液购自天根生化公司；PCV-2抗体检测试剂盒购自北京金诺百泰生物技术有限公司；Mhp抗体检测试剂盒购自IDEXX公司；HPS血清微量平板凝集试验(MAT)抗体检测方法，由本实验室自建。

1.3 检验用菌毒种PCV2 RPVS0301株，F11代，病毒含量106.50TCID50/mL，仔猪的攻毒途径和剂量为肌注4.0 mL和滴鼻4.0 mL；Mhp JX株，F8代冻干组织毒，最小发病剂量(MID)为0.005 g，攻毒剂量为100 MID；HPS 4型RPBS0904-11株，F5代，仔猪发病剂量为3.28×109～4.33×109CFU；HPS 5型RPBS0905-3株，F5代，仔猪发病剂量为1.68×109～2.21×109CFU；菌毒种均由天津瑞普生物技术股份有限公司制备、鉴定、保存和供应。

1.4 实验动物3～4周龄健康易感猪(包括三元仔猪和长大二元仔猪)，PCV2 抗原抗体、Mhp抗原抗体、HPS血清抗体及鼻拭子HPS抗原检测阴性,PRRSV、PRV、SIV血清PCR检测抗原均为阴性，购自天津周边散养户。

1.5 制苗用抗原的检验取PCV2 Cap蛋白，Mhp灭活菌体抗原，HPS 4，5型抗原经超声处理后，进行SDS-PAGE分析及Western blot鉴定。在15 V 30 min条件下，转至硝酸纤维膜(NC)上，4℃、5%脱脂乳封闭过夜，分别用PCV2 Cap蛋白单克隆抗体、Mhp阳性血清、HPS 4，5型阳性血清在37℃作用1 h，PBS洗膜3次，再用1∶5 000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠(或羊抗猪或羊抗兔)IgG 37℃作用1 h，PBS洗膜3次后，进行DAB显色分析反应活性。

1.6 疫苗制备将水相与佐剂按70∶30的体积比混合，500～800 r/min搅拌20～30 min。在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.005%，充分混匀。最终使每头份疫苗中含灭活的PCV2 Cap蛋白应不低于50 μg，Mhp菌体蛋白应不低于100 μg，HPS 4型RPBS0904-11株至少为4.0×109CFU，HPS 5型RPBS0905-3株至少为2.0×109CFU。

1.7 疫苗安全性评价用3～4周龄三元仔猪10头，其中5头猪于颈部肌肉注射疫苗4.0 mL/头(2头份)，5头作为空白对照，连续观察14 d。接种后观察以下指标：连续测温7 d；接种疫苗前后体质量变化；接种疫苗后局部和全身不良反应情况观察；接种疫苗后14 d，剖检所有实验猪，观察疫苗接种部位疫苗吸收、肉芽肿情况，并取接种部位组织进行HE染色和分析。

1.8 疫苗有效性评价

1.8.1疫苗免疫 将该三联灭活疫苗颈部肌肉注射3～4周龄健康易感猪20头，2.0 mL/头，间隔2周采用相同的剂量和途径进行二免。同时设攻毒对照猪20头，空白对照猪5头。各组猪同条件下隔离饲养。

1.8.2抗体监测 采集免疫前、首免后14 d、二免后7 d、二免后14 d血清，检测PCV2 Cap ELISA抗体效价、Mhp ELISA抗体效价和HPS 4，5型MAT抗体效价。其中，PCV2血清ELISA抗体和Mhp血清ELISA抗体按照试剂盒说明书进行判定；HPS 4，5型MAT抗体检测中，效价≤1∶4，判为阴性，效价>1∶4判为阳性。

1.8.3PCV2攻毒保护试验 二免后14 d，从免疫组和攻毒对照组猪中各随机选取5头测体质量，分别用PCV2 RPVS0301株病毒液攻毒，8.0 mL/头，同时设5头空白对照。攻毒后连续观察28 d，于28 d 测体质量，采血分离血清，按PCV2 PCR方法检测血清中PCV2病毒核酸；扑杀所有实验猪，取腹股沟淋巴结，按免疫组化检测(IHC)方法检测PCV2抗原。根据相对日增重、血清中PCV2病毒核酸和IHC结果进行判定。a.病毒核酸检测：攻毒后28 d，采血分离血清，用PCR方法检测血清中PCV2病毒核酸，出现特异性条带，判为PCV2病毒核酸检测阳性，否则，判为阴性。b.淋巴结IHC：攻毒后28 d，扑杀所有猪，取腹股沟淋巴结，按照IHC方法进行检测，仔猪腹股沟淋巴结滤泡内可见棕黄色着染，判为PCV2阳性，否则，判为阴性。c.相对日增重：攻毒前与攻毒后28 d，将免疫组、攻毒对照组(不免疫)和空白对照组(不免疫、不攻毒)猪逐头测体质量，用SPSS软件进行组间平均相对日增重比较，当平均相对日增重与空白对照组比较有显著性差异时(P<0.05)，判为该组仔猪生长发育不良，有PCV2引起的临床症状。计算公式为：相对日增重=(攻毒后28 d体质量-攻毒当日体质量)÷(攻毒当日体质量×28)。符合上述判定标准中的任意两项时，即可判为发病或保护。

1.8.4Mhp攻毒保护试验 二免后14 d，从免疫组和攻毒对照组猪中各随机选取5头，于气管注射100 MID的Mhp强毒JX株，观察28 d，扑杀全部实验猪。按28评分法对各实验猪的肺炎病变进行评分，计算肺炎病变减少率，按下述标准判定。(1)MPS病变评分标准：通过肺小叶(左尖叶、左心叶、左膈叶、右尖叶、右心叶、右膈叶和副叶)特异性病变面积占各肺小叶总面积的百分比进行量化评定。每个肺小叶未见肺炎病变为0分；病变面积占肺小叶面积的1%～25%为1分；病变面积占肺小叶面积的26%～50%为2分；病变面积占肺小叶面积的51%～75%为3分；病变面积占肺小叶面积的75%以上为4分。每个肺小叶最高病变评分为4分，7个肺叶病变评分最大为28分。如肺叶正反面均有病变，以病变面积大的一面进行计分。(2)按照以下公式计算各组免疫猪的肺炎病变减少率：肺炎病变减少率=[(对照猪肺炎病变几何平均分-免疫猪肺炎病变几何平均分)/对照猪肺炎病变几何平均分]×100%。

1.8.5HPS 4，5型攻毒保护试验 二免后14 d，从免疫组和攻毒对照组猪中各随机选取10头，其中5头分别腹腔注射4型RPBS0904-11株菌液3.0 mL(4.1×109CFU)，另5头分别腹腔注射5型RPBS0905-3株菌液3.0 mL(2.30×109CFU)。逐日观察并记录仔猪发病死亡情况至14 d。按下述标准判定：a.死亡；b.出现发热症状，且体温升高至40.5℃及以上，并至少持续2 d；c.出现精神沉郁、喜卧、食欲减退、呼吸困难、跛行等临床症状；d.剖检可见多发性浆膜炎(胸膜炎、心包炎、腹膜炎等)、关节炎和肺脏表面或腹腔内有纤维素性渗出物。符合a判为发病，或符合d和b或c中的任何一项即可判为发病。

2 结果

2.1 抗原检验结果经SDS-PAGE(图1)和Western blot(图2)检测，PCV2 Cap蛋白抗原出现28 kDa大小的特异性条带；Mhp菌体抗原出现大小25～130 kDa的多条蛋白条带(包括蛋白P36、P46、P65、P74、P97、P102、P110等)；HPS 4，5型菌体抗原出现大小10～70 kDa 的多条条带(包括外膜蛋白和酶)。

M.蛋白Marker；1，3，5，7.PBS对照；2.Cap蛋白;4.Mhp菌体蛋白抗原；6.HPS 4型菌体抗原；8.HPS 5型菌体抗原图1 4种抗原的SDS-PAGE鉴定结果

M.蛋白Marker；1,4,5,8.PBS对照；2.Cap蛋白;3.Mhp菌体蛋白抗原；6.HPS 4型菌体抗原；7.HPS 5型菌体抗原图2 4种抗原的Western blot鉴定结果

2.2 安全性评价结果

2.2.1体温监测 疫苗2倍剂量接种实验猪，个别仔猪在接种疫苗后4 h体温一过性升高(P<0.01)，24 h后恢复正常，但免疫组与对照组均无显著性差异(P>0.05)(图3)。

图3 体温变化趋势图(**P<0.01)

2.2.2体质量监测 疫苗2倍剂量接种实验猪，在免疫前和免疫后14 d对免疫组与对照组分别测体质量，利用SPSS软件分析显示，免疫组与对照组平均日增重差异不显著(P>0.05，P=0.619)，表明疫苗对仔猪增重无显著性影响(图4)。

图4 平均相对日增重比较结果

2.2.3临床观察及剖检结果 疫苗接种实验猪后，14 d观察周期内免疫组仔猪全部健活，精神状态良好，行为、采食和粪便均正常。观察期结束后，各组实验仔猪注射部位未见明显的红肿、硬结，剖检观察疫苗吸收良好，无残留，无肉芽肿的形成；各主要脏器未见异常，未出现全身不良反应，免疫猪与对照猪相比接种部位剖检和HE染色检测无明显差异；表明该疫苗接种均未引起临床、局部和全身不良反应(表1，图5)。

表1 临床观察结果

A.免疫猪接种部位；B.免疫猪接种部位病理切片,HE染色；C.未免疫猪接种部位；D.未免疫猪接种部位病理切片,HE染色图5 免疫猪与未免疫猪接种部位剖检和病理分析结果

2.3 免疫猪抗体监测疫苗首免后14 d，个别猪只PCV2 Cap ELISA抗体转阳(S/P值≥0.4)；二免后14 d，免疫组所有猪的PCV2 Cap ELISA抗体全部转阳，S/P平均值达到1.291±0.091，对照组始终为阴性(S/P值<0.4)(图6A)；疫苗二免后7 d，免疫组所有猪的Mhp ELISA抗体全部转阳(S/P值≥0.4)，二免后14 d Mhp ELISA抗体S/P平均值达到1.133±0.150，对照组始终为阴性(S/P值<0.4)(图6B)；疫苗二免后14 d，免疫组所有猪的HPS 4，5型MAT抗体全部转阳，分别为1∶27.9和1∶21.1，对照组始终为阴性(MAT抗体效价<1∶4)(图6C，D)。

A，B.PCV2、Mhp ELISA抗体变化趋势； C，D.HPS 4，5型MAT抗体变化趋势图6 三联苗免疫猪抗体变化

2.4 PCV2攻毒保护试验在PCV2攻毒试验中，免疫攻毒组平均相对日增重与空白对照组差异不显著(P>0.05，P=0.726)，攻毒对照组与空白对照组差异不显著(P>0.05，P=0.423)；血清病毒核酸PCR检测，免疫组4/5阴性，攻毒对照组4/5阳性；免疫组化检测，免疫组4/5阴性，攻毒对照组5/5阳性。综合判定，疫苗免疫攻毒组为4/5保护，攻毒对照组4/5发病，空白对照组5/5正常(表2)。

表2 二免后14 d PCV2攻毒保护结果

2.5 Mhp攻毒保护试验由表3、图7结果显示，疫苗免疫组猪肺炎病变减少率为61.35%。

表3 二免后14 d Mhp攻毒保护结果

2.6 HPS 4，5型攻毒保护试验HPS 4型免疫猪5/5保护，攻毒对照猪5/5发病(表4)；HPS 5型免疫猪4/5保护，攻毒对照猪4/5发病(表5)；三联苗对HPS 4,5型攻毒均达到80%的保护效果。

表4 二免后14 d HPS 4型攻毒保护结果

表5 二免后14 d HPS 5型攻毒保护结果

3 讨论

PCV2、Mhp与HPS混合感染给全球养猪业造成巨大经济损失，因此，对3种病原的防控尤为重要，目前已上市的用于预防3种疫病的疫苗包括PCV2全病毒灭活疫苗、PCV2基因工程亚单位疫苗(大肠杆菌源和昆虫细胞源)、Mhp灭活疫苗、HPS灭活疫苗(二价或三价)、PCV2、MPS二联灭活疫苗和PCV2、HPS二联灭活疫苗，主要以单苗或二联苗为主[22-25]，而对于3种抗原的三联疫苗尚未见报道。本研究首次研制PCV2、Mhp和HPS三联灭活疫苗，猪体试验证明该疫苗可以提供对3种病原的有效保护。

本研究利用杆状病毒表达系统表达的PCV2 Cap蛋白抗原、Mhp灭活抗原、HPS 4型和5型灭活抗原，结合水溶性佐剂制备三联灭活疫苗。首先对制苗用抗原进行特异性检验，PCV2 Cap蛋白大小为28 kDa；对于Mhp菌体抗原，已鉴定清楚的有十几种免疫相关蛋白，主要包括细胞质蛋白P36，膜蛋白P46、P65和P74，黏附因子P97、P102、P110和P116等[26]，本研究鉴定出多条大小相似的条带；HPS 4，5型菌体抗原的蛋白成分主要为外膜蛋白和酶[27-28]，本研究出现相关大小的条带；结果均表明4种制苗抗原特异性良好。在安全性检验中，所有免疫猪精神、采食、呼吸、粪便和行为均未见异常，与对照猪无显著性差异，个别猪体温在接种疫苗后有一过性升高，24 h后恢复正常，未见局部和全身不良反应，与现行《中国兽药典》和《兽药质量标准》中猪用灭活疫苗安全性检验标准要求一致[29-30]。在抗体监测中，本研究以50 μg/头份剂量2次免疫试验猪，PCV2 ELISA抗体于二免后7 d全部转阳，与未免疫仔猪差异极显著(P<0.01)。刘国民等[31]报道杆状病毒表达蛋白以50 μg/头份剂量1次免疫，免后30 d抗体全部转阳。Mhp ELISA抗体于二免后14 d全部转阳(S/P≥0.4)，与未免疫组差异极显著(P<0.01)。崔腾飞等[32]在Mhp二次免疫效果的跟踪检测中，抗体水平低于本研究疫苗。HPS 4，5型MAT抗体于二免后14 d达到1∶16以上，未免疫组为阴性(MAT抗体效价<1∶4)。以上结果表明疫苗免疫产生了针对3种病原的特异性抗体。在攻毒保护试验中，疫苗对PCV2强毒攻击的保护率达到80%(4/5)；免疫猪较攻毒对照猪肺炎病变率减少了61.35%；疫苗对HPS 4型强毒攻击的保护率达到100%(5/5)，对HPS 5型强毒攻击的保护率达到80%(4/5)。综上所述，本研究制备的三联灭活疫苗，在安全性、抗体水平和攻毒保护方面均达到较好效果，将为后续该三联疫苗的研制奠定坚实的基础。