王晓丽 ，李春霞 ，陈倩 ，王佳 ，王涛 ，陈晓鹏

（1.天津中医药大学，组分中药国家重点实验室，天津 301617；2.天津同仁堂集团股份有限公司，天津 300385）

肠道菌群被认为是人体内不可或缺的“器官”，其代谢产物如短链脂肪酸（SCFAs）也被证实生物学作用显著。SCFAs主要包括碳原子数小于6的、有挥发性且溶于水的游离脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、己酸、异戊酸。现有研究表明SCFAs在协调肠道稳态、葡萄糖功能、食欲、能量代谢的调节、炎症和免疫能力以及肿瘤和结肠癌等方面有积极的作用[1]。有研究表明SCFAs可以促进下游因子的分泌[2]，如胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和肽YY（PYY），其会促进肠道的糖异生作用并且能够降低血糖水平。另有研究显示SCFAs可以刺激瘦素的表达，还可通过G蛋白偶联受体抑制脂肪细胞的脂解作用，并激活AMP蛋白激酶（AMPK）是主要的细胞燃料指标和代谢稳态的主要调节者[3-4]。丙酸盐和丁酸盐激活肠道糖异生过程主要通过肠-脑神经回路的作用，以此来降低体质量并控制葡萄糖的代谢[5]。因为SCFAS是免疫应答的介质，所以能够增加外周血单核细胞（PBMCs）抗炎细胞因子的生成，而且通过促进外周调节性T细胞（Treg）分化过程，丁酸和丙酸还可以维持免疫稳态[6]。

在中国，中药治疗糖尿病及其并发症有着悠久的历史。愈来愈多的研究表明，中药可以通过多成分、多途径、多靶点治疗糖尿病并发症，其中，中药复方肾炎康复片对糖尿病肾病的治疗作用日渐受到关注。肾炎康复片是源于《金匮要略》中的肾气丸的演变方[7]，方中包含人参、西洋参、地黄、山药、杜仲（炒）、白花蛇舌草、黑豆、益母草、丹参、土茯苓、泽泻、白茅根、桔梗，其主要功效是养阴益气，健脾补肾，清解余毒。主治属于气阴两虚，脾肾不足，毒热未清的慢性肾小球肾炎，主要病理表现为神疲乏力、腰酸腿软、面浮肢肿、头晕耳鸣、蛋白尿、血尿等。临床证据表明[8-9]肾炎康复片与西药联用对糖尿病肾病的病理表现有较好的改善作用。并且课题组前期实验生理指标检测时发现[10]，db/db小鼠相比于正常小鼠，会出现糖尿病肾病的相关症状，且经肾炎康复片和二甲双胍干预后可明显减轻上述症状。

本研究从肠道菌群的代谢产物SCFAs的含量测定出发，寻找肾炎康复片干预糖尿病肾病的微生态治疗靶点，以期阐明基于肠道微生态的肾炎康复片治疗糖尿病肾病作用机制。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器 7890B-7000D气质联用系统（GC-MS/MS，Agilent，美国），5424R 离心机（30×1.5/2.0 mL，Eppendorf，德国），MM400 球磨仪（Retsch），AS60/220.R2电子天平，MIX-200多管涡旋振荡器（上海净信，中国），KQ5200E超声清洗仪（昆山舒美，中国）。乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、己酸、2-甲基戊酸、甲基叔丁基醚（色谱纯，CNW），异戊酸（aladdin，中国），磷酸（上海沪试，中国）。

1.2 样品的采集和制备

1.2.1 样品的采集 由南京大学动物模型研究中心提供的7周龄2型糖尿病BKS-Leprem2Cd479/Gpt小鼠[db/db 小鼠，体质量（40±2）g，无特定病原体]32只和正常小鼠[m/m 小鼠，体质量（18±2）g，无特定病原体]8只，许可证编号：SCXK2018-0008，将所有小鼠饲养在温度和湿度可控的实验室（室温：22℃，湿度：60%），光照/黑暗周期为12 h，可自由进食和饮水，所有实验方案均严格遵守中国科学技术部发布的《实验动物的护理指南》（2006）以及天津中医药大学动物使用和护理委员会颁发的《实验动物的使用护理指导意见》（IRM-DWLL-2019033）。课题组检测实验小鼠的生理指标时发现[10]，在体质量方面，db/db小鼠明显高于正常小鼠；其次在肾脏质量指数方面，与正常小鼠相比，db/db小鼠表现出更低的肾脏质量指数；在摄食和饮水方面，db/db小鼠的摄食和饮水量明显高于正常小鼠；并且db/db小鼠的空腹血糖状态和HbA1c的水平明显高于正常小鼠；同时db/db小鼠的尿量、微量白蛋白（MALB）、尿白蛋白肌酐比值（UACR）也明显增加。说明db/db具有糖尿病肾病的相关症状，db/db小鼠后期可自发形成糖尿病肾病的模型。

在对所有动物进行适应性喂养1周后，从db/db小鼠的眼底静脉丛中抽取0.2 mL血液以检测血糖水平。将它们随机分为4组，每组8只：模型组，肾炎康复片高、低剂量组和二甲双胍组，并将年龄匹配的m/m小鼠指定为正常组。肾炎康复片高剂量组的剂量为2 g/kg，低剂量组的剂量为1 g/kg，肾炎康复片低剂量组的剂量是根据2020年《中国药典》提供的人类临床剂量确定的。二甲双胍组的剂量为200 mg/kg。给药后3个月，将每只小鼠置于代谢笼中，收集24 h粪便，记录质量，并将其置于-80℃的冰箱中用于后期实验分析。

1.2.2 样品的制备 1）称取样本20 mg于2 mL的EP管中，加入1 mL磷酸（0.5%v/v）溶液，加入1颗小钢珠，20 Hz下球磨仪10 s，重复2次，涡旋10 min混匀（所有涡旋操作都将涡旋仪频率调到最大），再冰浴下超声5 min。2）12 000 r/min、4℃条件下离心10 min（离心半径=6 cm，下同），取上清液 100 μL 加入到对应的已编号的1.5 mL离心管中，加入500 μL含内标（2-甲基戊酸）的甲基叔丁基醚溶剂，涡旋3 min。冰浴下超声5 min；之后在12 000 r/min、4℃条件下离心10 min。3）离心完后吸取上层清液200 μL到编号有玻璃内衬管的进样瓶中，-20℃冰箱保存，待GC-MS/MS分析。

1.3 标准品溶液的配制及标准曲线的建立 配制0.005、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、5、8、10 和20 μg/mL不同浓度的标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以外标与内标浓度比（Concentration Ratio）为横坐标，外标与内标峰面积比（Area Ratio）为纵坐标，绘制不同物质的标准曲线。

1.4 色谱-质谱条件 色谱条件为色谱柱：DBFFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为氦气；流速为1.2 mL/min；采用分流模式，进样口温度为200℃，分流比为1∶1；升温程序：起始温度90℃保持1 min；以25℃/min升至100℃；以20℃/min升至150℃；以25℃/min升至200℃，保持0.5 min，后运行 3 min；进样量为 2 μL。

质谱条件为离子源：EI电子源；扫描模式：MRM采集参数见表1；电子能量70 eV；传输线温度230℃；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃。

表1 MRM采集参数表Tab.1 MRM acquisition parameter table

1.5 方法学考察 精密度：精密吸取混合对照品溶液，在“气相色谱-质谱条件”项条件下，连续进样3 d，每日6次，记录各成分的峰面积，计算相对标准偏差（RSD%）；加样回收率：精密称取样品，分别按已知质量分数的80%、100%、120%加入7种SCFAs对照品，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，在“1.4”项条件下分析，记录各成分的峰面积，计算加样回收率平均值。

1.6 样本质控分析 以混合标准溶液作为质控样本（QC），在仪器分析过程中，每隔10个检测分析样本插入1个QC样本，通过对同一质控样本质谱检测分析的总离子流色谱图（TIC）进行重叠展示分析，可以判断数据检测期间仪器的稳定性。

1.7 SCFAs的含量测定 将检测到的所有样本的积分峰面积比值代入标准曲线线性方程进行计算，进一步带入计算公式计算后，最终得到实际样本中该物质的绝对含量数据。

V1：磷酸体积（μL）；c：样本中积分峰面积比值代入标准曲线得到的浓度值（μg/mL）；V2：上清液体积（μL）；V：样品提取过程中加入提取液的体积（μL）；m：称取的样本质量（g）。

1.8 统计学分析 采用SPSS 23.0软件分析数据，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Pearson线性相关与回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 样本的质控分析 混合标准品的TIC图分析显示该实验检测得到的总离子流图重叠性高，见图1，即保留时间和峰强度均一致，表明此项目检测期间仪器稳定，为数据的重复性和可靠性提供了重要的保障。并且从图中可见SCFAs的色谱峰分离较好，峰形尖锐对称，能够对各代谢物进行质谱定量。

图1 混标溶液的TIC重合图Fig.1 TIC coincidence diagram of mixed standard solution

2.2 线性关系的考察 以外标与内标浓度比为横坐标，外标与内标峰面积比为纵坐标，绘制不同物质的标准曲线。得到线性回归方程。各待测物含量在线性范围内的线性良好，相关系数r2均大于0.998 1，满足检测需要。方法的线性回归方程、相关系数及线性范围见表2。

表2 7种短链脂肪酸的线性回归方程、相关系数及线性范围Tab.2 Linear regression equation，correlation coefficient and linear range of 7 kinds of short-chain fatty acids

2.3 方法学考察 利用混标溶液对检测过程的仪器的精密度进行考察。显示其精密度RSD<6.17%；选取1组样本按样本含量的80%、100%、120%加标量进行加样回收率实验，实验结果见表3，结果显示其平均回收率在90%～101%之间，说明实验过程中仪器稳定，数据可靠。

表3 精密度和加样回收率Tab.3 Precision and sample recovery rate

2.4 含量的测定 将检测到的所有样本的积分峰面积比值代入标准曲线线性方程进行计算，进一步带入计算公式计算后，最终得到实际样本中该物质的绝对含量数据。

2.5 统计学分析 将获得的各SCFAs的含量进行统计学分析，结果表明经肾炎康复片和二甲双胍的干预可不同程度地降低SCFAs的含量，并且统计学结果显示与模型组相比，给药组的丙酸含量显著降低（P<0.05）。见图3。

图2 粪便样品TIC图谱Fig.2 TIC spectrum of fecal sample

图3 肾炎康复片干预对丙酸含量的影响Fig.3 Effect of Shenyan Kangfu Tablets intervention on the content of propionic acid

3 讨论

前期课题组实验结果表明，糖尿病肾病小鼠的肠道微生态发生了严重的紊乱[10]；本实验发现与给药组相比所测的7种SCFAs的含量相较于模型组都有降低的趋势，其中丙酸的降低趋势具有统计学意义；这一结果与肠道菌群丰度的研究中肾炎康复片可以降低拟杆菌门的相对丰度密切相关。

丙酸主要是由肠道菌群中的优势菌群拟杆菌门参与代谢生成的，经结肠吸收以后由肝脏代谢参与糖异生并用作能量来源[11-12]，因此在能量代谢中发挥着重要作用，且对体内的炎症反应具有不可替代的作用。Bartolomaeus等[13]研究发现，在血管紧张素Ⅱ干预的小鼠高血压模型中，丙酸盐可以减弱多种T细胞对血管紧张素Ⅱ的应答，如辅助性T细胞17的减少，且丙酸盐发挥依赖于调节性T细胞平衡辅助性T细胞17对血管紧张素Ⅱ引起的效应因子的反应，从而发挥降低血压等作用。SCFAs可通过抑制核转录因子-κB（NF-κB）通路抑制炎症细胞分泌白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性因子[14-15]。所以依此来推断，丙酸可能在糖尿病肾病机体中通过调节异常的能量代谢过程和减缓肾脏的炎症反应来减轻糖尿病肾病的病理表现。

糖尿病肾病患者体内存在严重的肠道菌群紊乱可导致拟杆菌门的相对丰度降低，导致丙酸的生成量减少，从而对宿主多种生理过程产生重要的影响。肠道菌群主要由4大类菌门组成，厚壁菌门与拟杆菌门占主导，还包括变形菌门及放线菌门[11，16]。常见产生SCFAs的菌群主要为厌氧菌，包括拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、链球菌属等。本课题组的前期研究[10]发现经肾炎康复片干预的db/db小鼠在16S rDNA检测中，二甲双胍和肾炎康复片处理可显著降低拟杆菌门的相对丰度，而变形杆菌门的相对丰度并没有明显变化。拟杆菌和变形杆菌的相对丰度与小鼠的HbA1c水平、MALB和UACR呈显著的正相关。HbA1c是通过缓慢、持续及不可逆的糖化反应形成，其含量的多少取决于血糖浓度以及血糖与血红蛋白接触时间，被用作糖尿病控制的监测指标；MALB可作为全身性或局部炎症反应的肾功能指标；UACR是用于监测尿蛋白排出情况的一种新的可靠方法。并且将拟杆菌门的变化趋势与小鼠血液中的炎性因子NF-κB、TNF-α和IL-1β作相关性分析时发现这两者呈显著的正相关关系。短链脂肪酸的含量测定结果显示肾炎康复片可降低丙酸的含量，与肾炎康复片可使拟杆菌门的丰度降低结果是一致的，由此推出，各生理指标的变化与丙酸含量的降低有密不可分的关系的。

由上述结果可以得出，肾炎康复片改善糖尿病肾病的作用机制之一可能是改善肠道菌的代谢紊乱，降低拟杆菌的相对丰度，不仅会导致丙酸的生成减少，还可以抑制炎性因子的表达，回调机体的病理状态。