童双礼 吴洁 李莎莎 桑军军1,

[1.福建医科大学福总临床医学院(第九○○医院)烧伤整形科，福州 350001；2.福建医科大学福总临床医学院皮肤科，福州 350001；3.32231部队卫生所，福州 350001；4.厦门大学附属东方医院，福州 350001]

新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)是一种普遍存在于自然环境中的机会性致病真菌，艾滋病患者等免疫缺陷人群和免疫正常人群都可受累,能引起多种部位的感染，其中以中枢神经系统感染最为常见，预后也最为严重，可引发致命性的脑膜脑炎[1]。根据最新的流行病学研究估计，全球艾滋病患者中每年约有菌感染约278 000例，而感染死亡患者约181 000例[2]。

37℃生长、荚膜、黑色素、尿素酶等是目前已知的新生隐球菌的毒力因子[3]。蛋白酶在维持真菌生理正常功能中扮演着重要的角色[4]。新生隐球菌丝氨酸蛋白酶被认为是隐球菌的潜在毒力因子，但其在隐球菌感染中的作用和地位还未明确[5]。本研究中，我们通过基因敲除获得了丝氨酸蛋白酶家族基因中SER5(CNAG_02494)的基因缺失株，并对其表型和功能进行了初步探究。

1 材料和方法

1.1 材料

实验菌株和引物 本研究中使用的菌株为新生隐球菌格鲁比变种标准菌株H99，质粒为pJL517、pCH233，使用的引物见表1。

表1 本实验中使用的引物Tab.1 Primers used in this study

培养基、实验药品及试剂 YPD液体培养基(1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖)、YPD固体培养基(1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂)、山梨醇培养基(YPD+1 mol/L山梨醇)、选择培养基(YPD+200mg/L G418/Neomycin，YPD+100 mg/L Nourseothricin)、LB(0.5%酵母膏、1%蛋白胨、0.5%氯化钠)、LA(LB+100mg/L Ampicilin)、LK(LB+100 mg/L Kanamycin)、YNB培养基(0.67%酵母基本氮源、2%琼脂)、应激培养基(YPD或YNB加入对应的药剂)、In-Fusion©HD Cloning Kit、High-Fidelity DNA Polymerase、标准培养皿、镊子、玻璃珠、试管、细胞计数器、PBS等。……