廖紫娴，陈明瀚，钟敏，王一川，尚靖，岳芸芸

（中国药科大学，江苏 南京 210000）

0 引言

TSPO是一种位于线粒体外膜上包含169个氨基酸的疏水性跨膜蛋白。TSPO在外周主要分布于骨髓、脂肪、胃、皮肤等，在中枢以胶质细胞表达为主，包括小胶质细胞和星形胶质细胞。已有研究显示，TSPO与许多重要的生理功能有关。在胆固醇转运和类固醇生成方面，现已明确TSPO能促使胆固醇从线粒体外膜向线粒体内转运[1]。胆固醇是一种高亲脂性化合物，起源于细胞内不同的位置，不能自由扩散到线粒体内。而外线粒体膜上的TSPO的胆固醇识别序列CRAC可以结合胆固醇促进其转运到线粒体内。由于介导亲脂性胆固醇从胞质中通过线粒体膜间隙水溶液导入线粒体内部，因此这是调节类固醇生成的限速步骤[2]。在线粒体中，胆固醇在线粒体内膜转化成孕烯醇酮，孕烯醇酮在胞质中转化为孕酮，再进一步代谢为别孕烯醇酮及其他神经类固醇。而神经类固醇作为神经调节递质，影响多个神经递质及其受体功能，并能调节情绪、记忆和应激行为[3]。在卟啉的运输与积累方面主要与TSPO第二种亚型有关。TSPO主要分为两种亚型，TSPO1普遍存在于大多数真核细胞的线粒体外膜，而TSPO2则主要与血红素转运有关，位于细胞膜、细胞核和内质网[4]。原卟啉IX(PPIX)是TSPO的内源性配体，PPIX一方面用于合成血红素，另一方面未被用于合成血红素的游离PPIX可通过一种与TSPO相关的蛋白(ABCG2)进入细胞质，通过这种方式可以调节细胞内PPIX的含量。此外，TSPO与中枢神经系统疾病的发生具有一定的相关性，如阿尔茨海默病[5-6]、颞叶痴呆症[7]、多发性硬化症[8]、亨廷顿病[9]、肌萎缩性侧索硬化症[10]和帕金森病[11]，以上疾病均伴有TSPO表达上调的现象。而不同种类的焦虑症患者脑中TSPO水平均低于正常值[12]，而作为TSPO重要的下游神经类固醇别孕烯醇酮，在焦虑症患者的血清、血浆和脑脊液中也发现含量显著降低。此外，TSPO也参与细胞凋亡过程。当细胞在应激状态下能促使MPTP通道开放，允许质子与水分子等小分子进入线粒体，线粒体膜内外质子浓度梯度和电势梯度崩溃，大量水分子进入线粒体使线粒体内膜的嵴伸展变性，线粒体外膜膨胀破裂，导致细胞色素c和其他致凋亡蛋白释放到细胞质中，最终导致线粒体途径的细胞凋亡[13]。

斑马鱼作为一种模式生物由于其不可替代的优势已经获得越来越广泛的应用，例如利用药物处理、外科手术或者基因编辑技术构建人类疾病模型，可以实现药物的高通量筛选，极大地促进了药物研发进程。本研究利用实验室前期已构建成功的tspo功能缺失斑马鱼（tspocpu87）[14]与野生型斑马鱼进行对比，探索了tspo敲除突变体斑马鱼的部分表型，为进一步阐明tspo的生理功能以及相关疾病提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

尼罗红(上海阿拉丁公司)；醋酸钠(南京化学试剂公司)；邻联茴香胺(上海安谱公司)；过氧化氢、胆固醇、三卡因(美国Sigma公司)；95%乙醇、CMC-Na(上海沪试公司)；斑马鱼基础饲料(美国Zeigler公司)；SZX16体式荧光显微镜(日本Olympus公司)；SSC-DC578P彩色摄像机(日本Sony公司)；光照恒温培养箱(宁波赛福公司)。

1.2 动物

野生型AB系成年斑马鱼种鱼购自武汉国家斑马鱼资源中心，南京睿鹰润泽生物医药科技有限公司斑马鱼实验室自行繁育。tspo基因敲除突变体斑马鱼(tspocpu87)由实验室前期构建并繁育。维持循环水系统28.5℃，每天固定光照时间为14 h、黑暗时间为10 h，每天喂食2次。

1.3 胚胎的收取

实验前一天晚上分别取相同月龄的AB和tspocpu87成年斑马鱼，相同品种的斑马鱼雌雄各一置于繁殖缸的隔板两侧，实验当天早上八点半抽去隔板使雌雄斑马鱼自由交配产卵，1小时后收取胚胎并计数。将胚胎用egg water洗净后置于28.5℃光照培养箱中，后续可进行其他实验。

1.4 HCD造模

将斑马鱼胚胎随机分为四组：AB对照组，AB高脂组，tspocpu87对照组，tspocpu87高脂组。胚胎发育前四天在玻璃皿中孵化，每天换一次水。第五天斑马鱼开始进食，普通饲料喂养一天，防止直接高脂饮食造成肝脏损伤，并将幼鱼从表面皿换到圆缸饲养。第六天起对照组给与普通饲料，高脂组给与高脂饲料，在高脂饲养的第5、10、15天分别进行尼罗红染色。

正常饲料与高脂饲料的配制：将胆固醇与基础饲料溶解于乙醚中，研磨均匀，适度加热使粉体干燥，高脂饲料中胆固醇含量为8%。正常饲料的配置方法同上，但不添加胆固醇。

1.5 尼罗红染色

尼罗红是一种亲脂性荧光染料，可以对甘油三酯和脂肪酸进行染色。将斑马鱼幼鱼转移至0.5ug/mL尼罗红染液中避光染色30min，用egg water清洗3次，拍照前将斑马鱼置于0.4%三卡因溶液中麻醉，将已麻醉的斑马鱼转移到涂有4%CMC-Na凝胶的载玻片上，调整体态，在荧光显微镜下观察被染成橘黄色的脂质并拍照。

1.6 行为学测量

取相同月龄的AB和tspocpu87成年斑马鱼雌雄各八尾分别进行以下实验。

1.6.1 旷场实验(Open Field Test)

准备一个长30 cm，宽30 cm，高9 cm的正方形鱼缸，鱼缸在水平方向上分为两个区域：中间区域(upper zone)，边缘区域(bottom zone)。摄像机放置于鱼缸上方记录5 min斑马鱼在水平方向上的运动视频。处理视频资料并分析统计每尾斑马鱼运动轨迹，运动热图，总移动距离，移动速度，静止时间，静止频率。

1.6.2 新鱼缸实验(Novel Tank Test)

准备一个上底26 cm，下底21 cm，高15 cm，宽6 cm的梯形狭窄透明鱼缸，最大程度装满水，在鱼缸的背面和侧面贴上白色纸张有利于记录斑马鱼的行动轨迹，鱼缸在垂直方向上分为上下两个区域：顶部区域(upper zone)，底部区域(bottom zone)。摄像机放置于鱼缸侧面记录5 min斑马鱼在垂直方向上的运动视频。处理视频资料并分析统计每尾斑马鱼运动轨迹，运动热图，总移动距离，移动速度，静止时间，静止频率。

1.7 血红蛋白染色

用配置好的邻联茴香胺染液对发育至48 hpf时期的斑马鱼胚胎进行血红蛋白染色，将胚胎置于6孔板中，每孔加入2 mL染液，避光染色15 min，用egg water清洗3次，将斑马鱼转移到涂有4% CMC-Na凝胶的载玻片上，调整体态使幼鱼腹面朝上，于显微镜的明场下观察并拍照。

邻联茴香胺染液的配制：取邻联茴香胺粉末60 mg，醋酸钠30 mg，无水乙醇40 mL，30%过氧化氢650μL，用TBST定容至100 mL。配置该染液时注意避光操作，现配现用。

1.8 斑马鱼尾鳍再生实验

取成年斑马鱼(4 months post fertilization)，于0.4%三卡因溶液中麻醉，置于玻璃板上。使用手术刀整齐切除1/3尾鳍，于显微镜明场下拍照。尽快放回水中待其苏醒，七日后再次拍照，对比尾鳍再生的状况。

2 结果

2.1 tspo敲除抑制高胆固醇饮食诱导的斑马鱼幼鱼脂质蓄积

TSPO参与了胆固醇进入线粒体的转运，将胆固醇转化为类固醇的前体孕烯醇酮，这是类固醇生成的第一步，也是限速的一步。尼罗红染色反映了斑马鱼体内脂质蓄积的程度。结果显示，在AB型斑马鱼中，高脂组的荧光强度大于对照组，在tspo敲除斑马鱼中也体现这一趋势，高脂组的脂质蓄积程度大于对照组。同时，tspo敲除斑马鱼中无论是对照组还是高脂组的荧光强度均弱于AB型斑马鱼中对应的组（图1）。这说明tspo敲除型斑马鱼在脂质蓄积方面与AB型斑马鱼存在差异，验证了TSPO参与胆固醇转运的生理功能。

图1 AB型斑马鱼与tspo敲除型斑马鱼的尼罗红染色。比例尺=400 um。

2.2 TSPO功能缺失的斑马鱼表现出抑郁焦虑症状

斑马鱼的旷场实验与新型鱼缸实验通常用于检测斑马鱼的焦虑与抑郁状态。当斑马鱼被放入一个全新鱼缸内，最初在边缘地带滞留时间和沉底时间较多，且更偏向于静止不动。当斑马鱼适应该环境后，在该区域中心地带和顶部区域滞留时间和运动均增加。斑马鱼自发地接近该领域边缘地带的特征称为趋触性，自发地接近该领域底部的特征称为趋地性。由于焦虑通常是伴随着探索性行为的减少以及趋触性和趋地性。所以通常认为，斑马鱼在鱼缸边缘区域和下半部分的时间越长，运动距离减少和速度降低，静止时间越久和次数越多更偏向于焦虑状态。

在旷场实验中，tspocpu87斑马鱼比AB型斑马鱼更喜欢绕着鱼缸边缘探索，较少去到鱼缸的中间区域，在新型鱼缸实验中，tspocpu87斑马鱼更倾向于在鱼缸底部运动。并且无论在旷场实验还是新型鱼缸实验中，tspocpu87斑马鱼的移动距离更短，速度更慢。此外，旷场实验中tspocpu87斑马鱼的静止时间和静止频率都高于AB型斑马鱼，但在新型鱼缸实验中二者差异无统计学意义（图2）。从整体来说，tspo基因敲除后，斑马鱼更偏向于在鱼缸边缘区域和底部区域活动，更多的静止状态，表现出更高的焦虑抑郁倾向。

图2 tspo敲除型斑马鱼具有抑郁焦虑的倾向

2.3 TSPO功能缺失影响斑马鱼的繁殖能力

对AB型和tspocpu87斑马鱼的产卵数量进行比较，结果表明二者之间具有显著性差异。tspocpu87斑马鱼的产卵数量显著低于AB斑马鱼（图3）。由此判断tspo敲除使斑马鱼的繁殖力降低。我们推测这可能是由于TSPO功能缺失使斑马鱼胆固醇转运过程受到影响，进而影响到斑马鱼体内各类激素合成。但tspocpu87中激素水平尚有待进一步研究。

图3 AB型斑马鱼与tspo敲除型斑马鱼的产卵数量统计（n=48对/基因型）

2.4 tspo基因可能不参与斑马鱼血红蛋白的生成

TSPO主要分种亚型，TSPO1普遍存在于大多数真核细胞的线粒体外膜，而TSPO2则主要与血红素转运有关[15]。邻联茴香胺主要对血红蛋白进行着色，可以反映红细胞的分布。有文献报道，使用抑制剂PK11195和Morpholinos两种方式抑制tspo功能均能显著抑制斑马鱼初始造血能力[16]。但本研究结果显示，tspocpu87斑马鱼的红细胞着色程度和区域大小均与AB型斑马鱼差异无统计学意义。且使用TSPO抑制剂PK11195（10 uM）也不影响斑马鱼红细胞的表达（图4）。由此我们推论tspo敲除不影响斑马鱼血红蛋白的表达。而已有研究中利用Morpholinos敲降斑马鱼tspo影响斑马鱼血红蛋白生成可能是由于MOs的非特异性或毒性所造成的。

图4 tspo基因敲除与PK11195（10 uM）对斑马鱼血红蛋白含量的影响。比例尺=400 um。

2.5 TSPO功能缺失不影响斑马鱼成鱼的组织再生

由于TSPO参与细胞凋亡过程，而细胞凋亡在组织重塑、再生和形态形成过程中起到了重要作用[17]，所以我们探究了tspo功能缺失是否影响成年斑马鱼组织再生能力。我们选取相同月龄的AB型和tspocpu87成年斑马鱼进行尾鳍部分切除，观察尾鳍再生状况。结果显示，tspocpu87斑马鱼尾鳍再生区域的大小与形状均与AB型斑马鱼相似，未表现出显著差异（图5）。因此，我们推测tspo敲除不影响斑马鱼成鱼的组织再生能力。

图5 tspo功能缺失对斑马鱼组织再生的影响。比例尺=400 um。

3 讨论

TSPO作为一种广泛分布的位于线粒体外膜的跨膜蛋白，与许多重要的生理功能有关，包括胆固醇转运和类固醇生成，细胞呼吸和免疫调节等。TSPO一般在脑组织中表达程度很低，但TSPO的表达水平在由炎症介导的小胶质细胞激活时明显提高，是反映小胶质细胞活化的敏感的生物指标，这一特性决定了TSPO可作为检测神经炎症的靶点[18]。在临床上，TSPO配体常用于正电子发射断层成像技术(Positron Emission Tomography, PET)。但我们对TSPO的更为详细的生理功能以及如何发挥效应仍知之甚少，这仍需要大量的工作去阐述。

我们首先探究了tspo基因敲除对斑马鱼脂质方面的影响，从尼罗红染色结果可以看出tspo敲除的确影响了胆固醇在斑马鱼体内的合成与蓄积，这与文献报道一致。由于胆固醇合成受阻可能会影响到下游产物四氢孕酮含量降低，而四氢孕酮与抑郁水平显著相关，并且四氢孕酮具有抗焦虑和镇静的作用，已被FDA批准用于治疗产后抑郁症。继而我们从行为学实验验证了tspocpu87斑马鱼的抑郁倾向。同时性激素中的孕甾酮等受类固醇合成抑制的影响，也可能是tspocpu87斑马鱼生殖力下降的原因之一[19]，具体表现为产卵数量的降低。此外我们还探究了tspo在造血方面是否发挥作用，结果显示tspocpu87斑马鱼表现出与野生型斑马鱼相似的血红蛋白合成能力，并没有表现出明显差异。并且tspo基因缺失也没有在组织再生方面产生效应，具体表现为tspocpu87斑马鱼尾鳍再生程度与AB型斑马鱼相似。本研究只是初步探究了tspo-/-斑马鱼部分表型，更为深入的机制研究以及TSPO的其他功能的探索有待后续进一步的研究。