杨菁 周谋 林放 施琳颖 李艳辉 李文丹 单桂秋

创伤发生后的止血、组织修复是创伤修复过程中的两个重要环节，通常止血药物仅具有止血作用，很少同时具有促进创伤愈合的效能。传统的止血方法主要有压迫止血和药物促凝止血两种，但不管是物理还是化学的止血方法，都存在一定的局限性，止血效果不理想[1]。用于止血的生物材料很多，羧甲基壳聚糖和明胶因具有良好的生物相容性、低刺激性、低抗原性而在临床上得到广泛使用[2-3]。富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）是自体全血离心分离

后获得的富含高浓度血小板的血浆制品，因其富含多种促进组织再生的生长因子、细胞因子和抗菌肽等生物活性物质而具有明显促进创伤修复作用[4-5]。本研究团队多年前已致力于将止血材料和PRP进行有机结合，试图研究一种既有止血功能，又能很好促进创伤修复的复合敷料。经过多年探索，初步研制了CMC/GMs/PRP复合敷料，并对其形态、吸水性能、孔隙率、力学性能、体外降解、体外生物相容性和血液相容性等性能指标进行了检测[6]，基本满足各项要求。本文是在前期课题研究基础上的延续性研究，通过建立新西兰兔肝创伤出血模型，用前期制备的CMC/GMs/PRP敷料进行初步的止血、促进创伤愈合和安全性评价，为其进入临床应用提供动物实验证据。

材料与方法

1 设备材料 全自动血液成分分离机，日本Terumo公司，型号T-ACE Ⅱ；全自动血细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号BC-3000；水浴两用振荡器，上海悦丰仪器仪表有限公司，型号SH2B；磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限公司，型号DH-101S；电子精密天平，德国Sartorius公司，型号BS124S；CMC/GMs/PRP复合敷料，本研究团队自制；术益纱，青岛博益特生物材料股份有限公司，批号800111；无菌医用脱脂纱布，广州市天河豪政卫生材料厂，批号20180901； 3%戊巴比妥钠、利多卡因，本院动物实验中心提供；无菌手术包，本院消毒供应科提供等。

2 实验动物及其分组 新西兰兔2 0只，体重为2.8～3.1 kg ， 实验动物许可证号：SCXK（粤）2014-0023，合格证号：NO44007600005516，设施合格证号：SYX（粤）2014-0100。实验动物由广州市花都区花东信华实验动物养殖场提供，南部战区总医院实验动物中心进行饲养及实验。符合动物伦理学要求。实验分组：将实验兔于室温条件下饲养1周后随机分成A、B、C、D四组，即A组：空白对照组，不敷纱布，自然止血； B组：实验组，创口敷CMC/GMs/PRP敷料；C组：阴性对照组，创口敷普通纱布；D组：阳性对照组，创口敷术益纱敷料（市售）。每组5只，分笼饲养。

3 兔肝出血模型建立 用2%戊巴比妥钠溶液按35 mg/kg的剂量沿耳缘静脉注射进行麻醉，将其四肢固定在实验台上，于肝脏相应部位备皮约15 cm×20 cm，铺上创巾，暴露切口部位。酒精消毒后，用手术刀切开皮肤、腹膜，暴露肝脏，并在其表面制备“#”形长约20 mm、深5 mm的四道伤口。

4 实验处理 实验前血液涌出后，A组仅用无菌医用脱脂纱布吸收创面渗出的血液，不敷纱布；B、C、D组分别用CMC/GMs/PRP敷料、普通纱布、术益纱敷在出血伤口处，如图1所示。当敷料被出血湿透后添加普通纱布吸收血液，每隔10 s观察一次创口止血情况，继续观察直到完全止血后关闭腹腔。用秒表记录止血时间，用称重法计算出血量。术后，以20 IU/kg青霉素钠配以0.9%的生理盐水静脉注射，防止感染，每天1次。详细观察伤口变化情况，并做好记录。

图1 A、B、C、D四组使用不同实验方法止血后的正面图

5 止血时间和出血量计算 止血时间计算：从造模出血到停止出血所用时间，用秒表计时，每隔10 s观察一次，记录止血时间。出血量的计算：用天平精确称量各组备用止血材料使用前的干重、吸收血液后的湿重。计算方法：出血量（g）=止血材料吸收血液后的湿重-止血材料吸收血液前的干重。

6 促进愈合作用实验观察 包括肝脏出血创口修复的外观和组织学观察。分别于术后第 1、2、3、4周每组取1只实验兔打开腹腔，观察创伤处理部位的修复和敷料的降解吸收情况，之后取创口处的肝组织块，用4%多聚甲醛固定后行HE、MASSON染色，低倍镜（×20）下观察组织结构的变化。

7 安全性实验 术前、术后第 1、2、3、4周每组分别取5、4、3、2只实验兔的静脉血，采用血细胞分析仪检测白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白浓度（HGB）、血小板计数（PLT），以观察使用复合敷料后血液学指标变化来反映实验兔的炎症反应情况，从炎症反应的角度观察复合敷料的安全性。

8 统计学方法 本实验中所有数据均采用 ±s表示，数据用IBM SPSS Statistics 20和R 4.1.0软件进行处理。我们采用重复测量方差分析，评估处理组间、各时间点间各项指标的差异。如果处理和时间的交互作用具有统计学意义，继而分析处理或时间的单独效应，否则只关注相应的主效应。我们通过两两比较，识别两种特定处理之间或两个特定时间点之间指标差异的统计学意义。我们采用bonferroni法校正两两比较的P值。设定P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 止血时间和出血量的实验结果 B组的止血时间和出血量均小于其他组别，其中，与A组和C组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；与D组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

表1 四组新西兰兔肝出血模型止血时间和出血量

2 促进愈合作用实验观察结果

2.1 外观观察：术后创口逐渐修复，修复速度B组最快，D组次之，C组尚可，A组最差。B、D组的创口敷料逐渐降解吸收。图2显示：术后4周肝脏创口修复的外观状况，A组肝脏未完全愈合，组织黏连较严重；B、D组的肝脏创面已基本愈合，两组敷料已降解且被吸收，无明显组织黏连现象；C组肝脏创面基本愈合，但组织仍存在粘连现象。

2.2 促进创口愈合作用的组织学观察结果

2.2.1 HE染色观察组织学变化：由图3可见，A、C组肝窦扩张（黑色箭头）、充血严重（白色箭头），肝组织的炎性细胞浸润较明显，且部分肝细胞呈现空泡样变性（红色箭头）；而B、D组的肝窦扩张、充血较轻，肝组织的炎症细胞浸润程度轻，很少见到肝细胞的空泡样变性。

图3 各实验组术后第1、2、3、4周创伤处置部位肝脏组织的HE染色图（20倍）

2.2.2 MASSON染色观察组织学变化：由图4可见，创伤实验4周后，A、C组肝细胞充血，坏死较严重，肝纤维化严重（黑色箭头）；B、D组肝细胞充血和纤维化程度明显较轻。

图4 各实验组术后第1、2、3、4周出血部位肝脏MASSON染色图（20倍）

3 复合敷料的安全性实验检测结果 与造模前相比，第2、3周A组白细胞明显升高，第2周血小板明显升高（P＜0.05）；B组4项指标的差异均无统计学意义（P＞0.05）；第4周血小板有升高，差异无统计学意义（P＞0.05）；D组白细胞有升高（P＞0.05）；第2、3周血红蛋白有升高（P＞0.05），差异均无统计学意义，结果见表2～表5。

表2 各实验组白细胞计数结果

表3 各实验组血红蛋白检测结果

表4 各实验组红细胞计数结果

表5 各实验组血小板计数结果

讨 论

目前研究较多的生物止血材料有壳聚糖类、胶原类、海藻酸盐类、氧化纤维素和氧化再生纤维素类[7]等，但其各有优缺点。研制复合材料，不仅可以发挥各种材料的优点，还可克服单一材料的缺陷，更可能扩大生物材料的应用范围。

羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）由壳聚糖经甲基化制备而成，含有阳离子（-NH3+）和阴离子（-COO-） 基团，具有良好的抗菌活性，可防止伤口感染，促进细胞增殖、加速胶原沉积，有效促进创面愈合[8]。明胶作为胶原的降解产物，是动物结缔组织中的胶原经部分水解和热变性而成的大分子蛋白质，因其理化性能好，安全无毒、生物相容性好，现已成为控释剂的理想载体，在生物、医学、农药等领域展现出良好的应用前景[9]。有学者将壳聚糖和明胶联合应用，其止血和促进创面愈合的效果优于单独使用，但应用范围以治疗表面创伤和骨组织创伤居多[10-11]。本课题组在前期研究基础上[6]，将羧甲基壳聚糖和明胶进行交联，并将PRP负载其中，最终制成可降解且具有缓释PRP中生长因子的壳聚糖-明胶复合敷料（CMC/GMs/PRP）。通过与临床应用的壳聚糖成品敷料（术益纱）进行对比研究，结果表明，复合敷料组的止血时间最短、出血量最少，明显小于空白对照组和阴性对照组，且差异有统计学意义；与临床常用的术益纱相比，复合敷料的止血时间相对较短、出血量相对较少，但其差异无统计学意义，这说明CMC/GMs/PRP复合敷料的止血效果与其相当。该复合敷料的止血机制是：在接触肝脏出血位置后，通过阴阳离子的吸附作用，将带阴离子的红细胞聚集到一起，形成血凝块；此外，壳聚糖还可促进血小板的黏附和聚集，加快了血液凝固从而促进止血[12]。

促进创口愈合作用的组织学实验观察结果显示：CMC/GMs/PRP复合敷料组促进肝创伤修复效果明显优于其它三个组，术后4周，HE染色显示其肝组织结构基本恢复正常，肝窦扩张、充血有明显减轻，炎症细胞浸润程度低；MASSON染色结果也显示受损肝组织的充血程度和纤维化程度明显较其它组别轻。上述病理结果说明联合PRP后，PRP中高浓度血小板所释放的大量生长因子、细胞因子和抗菌肽等生物活性物质较好地发挥了促进创伤修复作用。

血常规是手术前后重要的监测指标，与创伤严重程度、出血量有直接的关系，对创伤的预后有着重要的临床意义[13-14]。术后4周，对新西兰兔进行腹腔解剖，通过观察肝脏发现，A组肝脏未完全愈合，组织黏连情况较严重，因此，WBC计数明显升高，差异具有统计学意义；B、D组的肝脏创面已基本愈合，两组敷料已降解且被吸收，无明显组织黏连现象，WBC、RBC、HGB、PLT计数与实验前相比，差异无统计学意义；C组肝脏创口外观观察也基本愈合，但组织仍存在一定的粘连现象，可能存在一定的血小板消耗，因而出现PLT计数下降，但差异无统计学意义。复合敷料中PRP所释放的生物活性物质在促进创伤修复的同时实验兔的白细胞计数并无明显变化，说明该复合敷料没有诱发实验兔的炎症反应，间接说明其安全性有保障。上述结果可以相互佐证，说明实验兔在受到创伤后，负载PRP壳聚糖-明胶复合敷料具有良好的止血和促进创面愈合的作用，且有较好的安全性，具有进一步研究的价值和应用前景。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突