高瞻 肖军 李小薇 李翠莹

短时间暴露于低氧时，机体红细胞和血红蛋白水平会快速升高以改善组织供养，而长期处于低氧环境是导致继发性红细胞增多症的重要原因。从生理角度来看，胚胎所处的子宫和成人骨髓都是相对低氧的造血环境，因此从病理到生理、婴儿到成年，低氧和红细胞生成都密不可分。低氧诱导因子（hypoxia inducible factors，HIFs）是感受和调控细胞氧水平的中枢调节因子。HIFs最早由SEMENZA从Hep3B细胞中纯化，认为其诱导促红细胞生成素（EPO）和其他氧敏感基因表达[1]，随后RATCLIFFE和KAELIN证实HIFs α亚基内特定脯氨酸残基的羟基化是控制其活性的关键结构[2]，奠定了研究动物细胞氧感应的分子基础。HIFs与造血的关系一直是国内外的研究热点，目前认为HIF-1α是调节造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）代谢的主要因子，其通过影响HSCs糖酵解、线粒体呼吸和氧化应激调控细胞自我更新和分化，而越来越多的研究表明HIF-2α在调控红细胞生成方面功能更加突出，这不仅源于其最重要的靶基因-EPO是红细胞成熟的关键因子，也因其对造血器官正常发育以及机体铁代谢平衡维持具有重要意义，本文就此进行梳理和阐述，旨在为防治红细胞增多症、贫血等疾病提供新的思路。

1 HIF-2α结构及低氧应答通路 HIF-2α又称内皮PAS区域1蛋白（endothelial PAS domain protein 1，EPAS1），属于碱性螺旋环螺旋（bHLH）Per-ARNT-Sim（PAS）转录因子家族，HIF-2α N端含PAS和bHLH序列，参与HIF-2α与HIF-1β之间的异二聚体化反应，此外bHLH结构域还介导缺氧反应元件（HREs）与靶基因启动子或增强子的共有序列（G/ACGTG）结合。HIF-2α有两个转录激活域（TAD）：C末端激活域（C‐TAD）和N末端激活域（N‐TAD），两者与转录辅助因子如CBP/p300相互作用，前者促进HIF‐1α和HIF‐2α共同靶基因的表达，后者促进HIF‐2α特异性靶基因表达，而与N‐TAD重叠的氧依赖性降解区（ODD）调控HIF-2α结构稳定性[3]。

常氧条件下，HIF-2α ODD区的两个保守脯氨酸残基（Pro-405、Pro-531）被脯氨酰羟化酶（PHD）羟基化，使HIF-2α与肿瘤抑制因子（VHL）结合，后者招募E3泛素酶连接复合物最终使HIF-2α多泛素化降解，半衰期约5分钟[4]。此外，常氧下HIF-2α C-TAD结构域中的天冬酰胺残基Asn-847被HIF抑制因子（FIH）羟基化，抑制HIF-2α与CBP/p300的相互作用。PHD和FIH都是铁和α酮戊二酸依赖的双加氧酶，缺氧时两者活性下降，导致HIF-2α的羟基化受抑制，此时稳定的HIF-2α进入细胞核与HIF-1β形成二聚体，结合低氧反应元件（HREs）调节靶基因表达[5]。

2 HIF-2α是胚胎造血的必需因子 胚胎发育的最早阶段实际上是没有任何血细胞的，当胚胎成长至一定体积，子宫内氧和其他必须的因子无法经扩散支持胚胎发育时，胚胎才会开始造血。第一个造血细胞在卵黄囊中胚层产生，然后出现于尿囊和胎盘，随后第一批具有成人造血干细胞（HSCs）功能特性的细胞在生血内皮的主动脉-性腺-中肾（AGM）区域中产生,它们迁移到胎儿肝脏、胎盘、脾，最终定居于骨髓产生各类血细胞，整个过程同时进行着内皮细胞的不断分化以及血管网络的构建。

HIF-2α的靶基因包括血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子受体（Flt）、一氧化氮合酶（NOS）等，对胚胎期造血阶段胚胎发育及血管形成具有关键的作用。早期研究发现HIF-2α缺陷小鼠发生出血，卵黄囊内血管无法保持分离的结构或组装成更大的血管并在胚胎发育期E9.5和E13.5之间死亡[6],而在HIF-2α敲除胚胎的血管内皮中表达HIF-2α cDNA可挽救血管发育并提高胚胎存活率，表明HIF-2α对胚胎发育期血管形成中起重要作用，是血管网重塑为血管的必要条件。COMPERNOLLE[7]等的研究显示由于VEGF合成不足，HIF-2α敲除胚胎超过半数死于心脏衰竭，而幼鼠死于呼吸窘迫综合征。即使极少数幼鼠得以存活，也表现出多器官功能障碍，包括心肌肥厚、肝脂肪变性、氧化应激增加相关的视网膜病变以及严重的造血缺陷，提示HIF-2α是胚胎期造血和器官发育的关键因子。近期有研究以斑马鱼为对象，发现HIF-1α和HIF-2α突变个体内皮-造血转化（EHT）相关基因Runx1、cMyb表达下调，HSCs产生减少，并进一步确定Nocth信号在HIFα调控EHT的下游发挥作用，揭示了HIF-2α调控胚胎造血的机制[8]。

3 HIF-2α直接或间接调节造血干细胞状态 人胚发育4个月后骨髓成为造血中心，骨髓的生理解剖结构为HSCs提供固有的低氧环境。HIFs是参与HSCs低氧应答通路的主要因子，HIF-1与HIF-2共同调控HSCs存活、静息和分化。Rouault-Pierre K等研究发现无论是常氧还是低氧，HIF-2α的敲除对于抑制造血祖细胞（HPCs）分化形成红系集落较HIF-1α敲除更为显著，但这可能与shHIF-1α细胞中HIF-2α水平代偿性升高有关，进一步通过异种移植模型发现shHIF-2α HPCs在小鼠体内6周后丢失率（70%）远高于shHIF-1α（26%），直到24周前者CD34+CD38-细胞减少程度都显著高于后者，表明HIF-2α维持人HPCs长期重建能力[9]。

HIFs的表达是整个造血微环境而不是某种单细胞类型的特征，在这些微环境中存在的其他因素也能诱导HIFs基因的表达，因此除了直接调控，HIF-2α也通过作用于造血微环境内的基质细胞间接调节造血干祖细胞的维持和分化。成骨细胞是维持造血的主要支持细胞，研究表明HIF-2α通过受体激活剂配体（RANKL）影响骨祖细胞向成骨细胞分化，并且HIFs的靶向转录因子Twist2与肿瘤坏死因子受体相关因子6（Traf6）参与成骨细胞与破骨细胞平衡的调节并维持骨内稳态[10]。造血微环境中内皮细胞对于支持红细胞生成也起重要作用,内皮细胞血管黏附分子-1（VCAM-1）是HIF-2α的直接靶基因，HIF-2α敲除小鼠VCAM-1表达显著降低导致正细胞性贫血，而恢复VCAM-1表达可促进红系祖细胞发育并挽救该表型[11]。GUARNERIO J等研究证明HIF-2α通过STAT通路促进一类表达干细胞抗原1（SCA-1）和血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）的骨髓间充质祖细胞（PαS+细胞）增殖并分泌CXCL10等细胞因子，维持造血干祖细胞静息而抑制其增殖和分化[12]，提示HIF-2α多方面调节造血干祖细胞状态。此外，微环境内与HSCs共定位的调节性T细胞（Treg）保护HSCs免受免疫攻击，近期研究发现HIF-2α而非HIF-1α的敲除使Treg细胞在抑制炎症方面发生功能缺陷[13]，初步揭示了HIF-2α对此类细胞的调节作用，为研究其间接调控造血功能提供了新的视角。

4 HIF-2α调控EPO表达的突出功能 EPO对红细胞生成至关重要，其通过促进红系前体细胞的存活、增殖和分化维持成熟红细胞的产生，保障血液的携氧能力。胚胎中肝脏是EPO产生的主要部位，而成人约90%的循环EPO来源于肾脏，肾源性和肝源性EPO的产生都与局部组织的氧合状态密切相关。

早期研究使用Cre-loxP重组酶系统敲除小鼠肾组织HIF-2α并确保肝脏和骨髓等器官中HIF-2α介导的缺氧反应仍然保持完整，发现突变小鼠存在红系造血缺陷，虽然小鼠肾脏HIF-1α及其靶基因表达升高但肾EPO及血清EPO水平显著下降，这表明肾脏中EPO的缺氧调节几乎完全依赖Hif-2α而非HIF-1α[14]。近期有研究使用荧光蛋白tdTomato特异性标记肾脏内产生EPO的细胞，证明肾髓质皮质管间质细胞是肾脏唯一产生EPO的细胞类型，并且此类细胞所在区域氧利用率大幅下降是激活EPO合成的关键[15]。尽管正常成人造血过程中，肝脏只合成少量EPO，但在严重缺氧的条件下，肝源性EPO的产生可占循环EPO的33%以上，相关研究表明对于不同年龄小鼠HIF-2α都是调节肝脏EPO表达的主要HIF，而肝内HIF-2α较HIF-1α优先结合EPO基因HREs是主要原因[16]。

EPO失调导致贫血或红细胞过度增多。MELANIE J PERCY等报道了一例家族遗传性红细胞增多症患者PHD2突变导致HIF-2α过表达，进而上调EPO造成红细胞异常增多[17]。另有研究对比居住于海拔3000-4500米的健康居民和以红细胞异常增多为特征的慢性高原病（CMS）患者，发现CMS患者骨髓细胞HIF-2α/EPO通路活性显著增强[18]。临床上，PHD抑制剂JTZ-951， Roxadustat及当归提取物ASP等都能通过稳定HIF-2α结构，提高HIF-2α在细胞内的水平治疗EPO生成障碍造成的慢性肾病贫血[19,20]。

5 HIF-2α与机体铁代谢的相互作用 红系前体细胞对铁的储存、利用水平决定着其是否能正常合成血红蛋白而最终成熟，人每天需要足够的铁维持生理造血，而HIF-2α从肠道铁吸收和铁调素水平等方面调控着铁稳态。

肠道铁吸收指十二指肠细胞表面的细胞色素b（Cytb）将三价铁还原为亚铁，后者通过二价金属离子转运体（DMT1）进入细胞，储存于铁蛋白或最经膜铁转运蛋白（FNP）进入血液，结合转铁蛋白（Tf）运输至各个部位。早期研究已证实DMTI、Tf、FNP以及铜蓝蛋白（CP）、转铁蛋白受体（TfR）等的铁代谢相关基因是HIF-2α的直接靶基因[21]，从肠上皮的生理特征也可以解释HIF-2α调节肠道铁吸收的作用：肠上皮下粘膜结构高度血管化，未进食时绒毛微血管血流量较小，此时上皮处于相对缺氧的状态，十二指肠细胞局部HIF-2α水平升高，增加铁吸收相关基因表达，以便餐后消化过程增加铁的摄取。

铁调素（hepcidin）是肝脏合成的肽类激素，可直接结合FPN抑制细胞排出铁，进而抑制体内铁的循环。ANDREW J等使用hepcidin/FNP基因敲除小鼠及全基因组RNA序列分析证明了肝脏hepcidin通过限制铁依赖性PHD酶活性调控肠道HIF-2α水平[22]。Sheila A等发现了与之类似的铁调节蛋白IRP/HIF-2α调控轴调节铁吸收与红细胞生成[23]，进一步说明铁代谢与HIF-2α间关系是相互且复杂的。与铁代谢异常相关的血液疾病包括缺铁性贫血、镰状细胞病（SCD）以及β地中海贫血等，以HIFs为靶目标的PHD抑制类药物对于缺铁性贫血的应用与肾病贫血类似。SDC和β地中海贫血本质都是无效造血，患者肝铁储存过载并且铁吸收率升高，已有研究表明破坏SCD小鼠肠道HIF-2α导致RBC、Hb和HTC升高，小鼠发生溶血并且红细胞存活率显著下降[24]。β地中海贫血与HIF-2α间的关系仍不明确，但越来越多的研究表明靶向肠道HIF-2α或是其上游的hepcidin/IRP的药物在铁过载相关血液疾病方面具有重要的治疗潜力[25,26]。

6 结语 从第一个造血细胞诞生开始，HIF-2α通过作用于局部组织和全身代谢多方面、多层次的调控着机体一生的造血，帮助机体获得足够的红细胞以适应各种生理刺激；HIF-2α及低氧适应通路成员（VHL、PHD等）的突变也与遗传性红细胞增多症、缺铁性贫血、慢性肾病贫血等病理过程密切相关，其靶向药物在多种血液疾病具有广阔的临床前景。总之，HIF-2α调控造血的重要作用毋庸置疑。另外，近期多项研究报道了HIF-2α在肺血管病变、血栓形成、肝/肾肿瘤发生发展中的作用[27-29]，而上述患者的造血功能和血液指标都发生显著改变，这不仅体现了HIF-2α调控细胞功能的广泛性与复杂性，也提示我们从更多角度探索HIF-2α在生理病理造血过程中的作用机制。相信未来将有更多针对HIF-2α及其相关通路的治疗措施不仅帮助我们攻克血液系统疾病，更为癌症等人类难题带来答案。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突