陈清艳 王秋实

胎儿和新生儿溶血病 （hemolytic disease of fetus and newborn，HDFN） 是由于母亲与胎儿血型不合，母亲体内产生针对胎儿血型抗原的特异性血型抗体，通过胎盘进入胎儿血液循环，致敏胎儿红细胞导致胎儿或新生儿发生同种免疫性溶血，主要引起贫血、黄疸、水肿、肝脾肿大等临床症状[1]，严重时可发展为核黄疸甚至死亡[2]。随着我国开放计划生育政策，多次妊娠引起的HDFN发病率逐渐增多，也逐渐受到临床重视，现就HDFN的发病机制和风险预测综述如下：

1 HDFN流行病学特点 ABO血型系统和Rh血型系统抗体是引起HDFN的主要血型系统，其中ABO血型不合引起的HDFN在我国最常见，主要为抗-A/B抗体。抗-A/B抗体多为天然的IgM抗体，O型血母亲在妊娠前可通过暴露于类血型物质产生IgG性质的抗-A/B抗体，数据显示O-A母婴血型发病率高于O-B母婴血型，第一胎即可发病，临床症状一般较轻，主要以黄疸为主[3-4]。

Rh血型系统抗体产生主要与输血和妊娠相关，Rh血型系统HDFN多为第二胎发病，由于现在常规检测D抗原，输血时采取同型输注的方式，D抗原阴性人群在亚洲人中比例低，抗D免疫球蛋白应用也逐渐增加，因此目前抗-D抗体引起HDFN明显降低。由于目前未推广E和C抗原配合输注，E和C抗原在人群中分布差异较大，Rh系统其他抗体如抗-E，抗-c抗体引起HDFN逐渐增多[5]。MN血型不合导致的HDFN与ABO血型系统类似，第一胎就可以发病，但是发病率明显低于ABO和Rh血型系统。目前已经报道的其他可能引起HDFN的稀有血型系统抗体还有Kidd系统、Duffy系统和Kell系统，但这些血型系统所致的HDFN病例较少。

2 HDFN发病机制 截止到2021年，ISBT（国际输血协会）已经确定43个红细胞血型系统，包含376个人类红细胞抗原，不同的红细胞抗原具有不同的结构和功能。血型抗原根据抗原决定簇可以分为糖类抗原和多肽抗原，ABO等糖类抗原对应产生IgM抗体，多肽抗原对应产生IgG抗体，例如HDFN相关的Rh、Kell、Duffy、Kidd和MNS均属于此类抗原。红细胞同种免疫抗体的产生涉及多种影响因素，例如抗原结构、抗原密度、炎症状态、抗原提呈能力、抗体分型、抗体通过胎盘的能力均可以影响抗体的产生以及抗体对胎儿红细胞的破坏能力。

2.1 红细胞同种异体抗体形成机制

2.1.1 抗原特征：人类血型系统具有多态性，其抗原表达量和抗原免疫原性在临床疾病中具有重要意义。ABO血型系统的A、B等位基因编码合成相应的糖基转移酶，A、B糖基转移酶作用于前体物质，催化不同类型的糖链生成而产生A、B抗原[6]。ABO血型系统抗原具有极强的免疫原性，ABO亚型由于蛋白编码区单核苷酸变异、内含子或启动子区域的变异致抗原表达减弱[7-8]。Rh血型系统的重要性仅次于ABO血型系统，分别由RHD基因和RHCE基因编码产生D、C、c、E、e五种抗原，其中C/c和E/e属于对偶抗原[9]。研究还发现Rh抗原的表达存在“剂量效应”，纯合子基因比杂合子基因个体表达更多的抗原[10]。另外，RHD基因编码区的碱基突变可以导致RHD蛋白氨基酸发生替换，产生弱D表型，表现为RhD抗原表达量明显减少，诱导机体产生抗体的能力减弱或者消失[11-12]。动物和人类研究中显示密度极高的抗原比密度适中的抗原免疫原性弱，而密度极低的抗原相对免疫原性更弱[13-14]。

2.1.2 抗原提呈能力：抗原提呈是抗原提呈细胞将抗原肽提呈给T细胞，诱导T细胞活化的过程。目前研究已经证实红细胞同种免疫中非自身红细胞抗原提呈与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分子有关，HLA基因复合体编码的HLA分子识别提呈外源性抗原肽与T细胞结合。有研究表明HLA-DRB1基因在第一次红细胞反应中起着重要作用，其中抗-D的产生与HLA-DRB1*01基因具有明显相关性，但是患者一旦产生红细胞抗体，再次接触红细胞抗原产生额外抗体的机会就增加[15]，有学者认为多重红细胞抗体形成与HLA-DRB1*15基因相关[16]。HLA等位基因作为决定人体对红细胞抗原易感程度的重要基因，多种不同的HLA分子可以提呈具有临床意义的红细胞抗原。

2.1.3 免疫细胞的调节作用：T细胞是人体内重要的免疫细胞，活化后分化为Th1、Th2、Th17、调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）和滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cell，Tfh）等不同的亚型，通过分泌免疫因子以及表面表达活化性或抑制性免疫受体对免疫应答进行调控。Treg细胞是T细胞亚群中的一类负性调节T细胞，活化后可以下调免疫应答从而减弱机体的免疫反应程度，在发生红细胞同种免疫的镰状细胞贫血病（sickle cell disease，SCD）患者中观察到外周血中Tregs活性降低，以及细胞因子IFN-γ表达水平升高，IL-10降低，Th1和Th2之间的免疫平衡被破坏[17]。另外，还有研究发现SCD患者由于长期处于溶血状态下，体内产生的血红素可以通过抑制DOCK8/STAT3信号通路从而抑制浆细胞的免疫功能，但是已经发生了同种免疫的SCD患者的B淋巴细胞对血红素的抑制作用无反应[18]。

Tfh是一类表型分化簇4 （cluster of differentiation 4，CD 4）和C-X-C基序趋化因子受体5（C-X-C motif chemokine receptor 5，CXCR5）双阳性的T细胞亚群，是B淋巴细胞效应的主要辅助细胞[19]。CD4+T细胞经抗原活化后表达诱导性协同共刺激分子ICOS，与B淋巴细胞表面的可诱导性共刺激分子配体ICOSL结合，诱导CD4+T细胞进一步分化为高表达趋化因子受体5（CXCR5）的Tfh。Tfh分泌的IL-4和IL-21诱导B淋巴细胞分化为浆细胞产生抗体[20-21]。多项研究证实Tfh细胞功能异常与多种疾病相关，GODEFROY[22]等发现发生同种免疫的SCD患者的Tfh表面表达一种含Ig及免疫受体酪氨酸抑制基序ITIM 结构域的T细胞免疫受体（TIGIT），与缺乏TIGIT的Tfh相比，表达该受体的Tfh上调共刺激分子和产生更高水平的IL-21，导致产生的红细胞同种抗体增加，在红细胞同种免疫的发病机制中起重要作用。

动物研究模型中进一步阐述了CD40/CD40L相互作用[23]、1型干扰素[24]、补体[25]和桥接通道树突状细胞[26]对诱导红细胞抗体产生的作用。

2.1.5 受体炎症状态：小鼠模型中证实IL-6对输血导致的同种免疫具有调节作用，T细胞表面表达IL-6受体信号驱动红细胞同种免疫小鼠模型中红细胞同种抗体的产生和CD4+T细胞分化为Tfh[27]。现在基于人类患者的研究也显示受体的炎症状态与红细胞同种免疫发生有关，据报道SCD、炎症性肠病和自身免疫性疾病等患者在输血过程中诱导红细胞同种免疫发生的风险都显著增高，SCD患者发生急性胸痛综合征和血管阻塞危象与红细胞同种抗体的产生紧密相关，炎症性肠病患者在输血过程中发生红细胞同种免疫的概率是未患炎症性肠病人群的3.5倍[28-29]。

2.1.6 机体免疫耐受：临床中发现不是所有暴露于非自身红细胞抗原的受血者和孕妇都会发生红细胞免疫应答，只有少数产生了可检测到的红细胞同种抗体。免疫 “应答者”的全基因组关联研究中显示不存在易感基因位点[30]。有人提出这类“无应答者”可能存在免疫耐受，在某些条件下对非自身抗原不发生反应，NATRAJAN等[23]通过CD4+T细胞耗竭或阻断CD40L在小鼠体内成功诱导了红细胞血型抗原免疫耐受的模型，证明了抗原特异性耐受的存在。由此可见，关于免疫“无应答者”的发生机制，以及在孕妇妊娠过程中是否发挥了保护作用值得进一步研究。

2.2 抗体进入母体作用机制

2.2.1 抗体分型：人体内免疫球蛋白分为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE五大类，其中IgG在人体血清中含量最高，也是唯一可以通过胎盘导致HDFN的抗体。IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四个亚型，其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目、位置不同决定其具有不同的效应功能：激活补体的能力依次为IgG3＞IgG1＞IgG2，IgG4无激活经典途径的能力[31-32]，IgG1和IgG3优先通过胎盘屏障[33-34]。HDFN发病风险与血清中的IgG1含量相关，当 IgG3与IgG1同步升高时，提示严重的HDFN[35]。另外，有文献显示HDFN患者溶血程度与特异性血型抗体Fc区域的多糖修饰相关，低岩藻糖基化的IgG1可以增强与FcγRIIIa受体的亲和力[36]，在NK细胞介导的细胞吞噬中发挥重要作用，导致HDFN患者溶血程度加重[37-38]。

2.2.2 胎盘转运能力：胎盘作为母体和胎儿进行物质交换的桥梁，其合胞体滋养层细胞表达的新生儿Fc受体（neonatal FcR，FcRn）的结构与MHC-I分子类似，可以介导母体IgG以pH依赖的方式与其结合从而转移到滋养细胞层进入胎儿血液循环[39]。IgG抗体的胎盘转运效率还与抗体Fc区域的多糖修饰有关，GALIT ALTER[40]和SALLIE R. PERMAR[41]等

发现双半乳糖化的抗体更易通过胎盘从而驱动NK细胞的脱颗粒效应和细胞因子分泌。虽然目前的研究证明IgG抗体Fc区域的不同糖基化水平与胎盘转运相关，但是具体作用机制仍不明确。

2.3 红细胞破坏机制：HDFN是发生在胎儿或新生儿时期的疾病，抗体如何通过胎盘引起同种免疫性溶血是其发病关键。目前认为主要有两种机制：一是IgG抗体通过胎盘进入胎儿血液循环后作用于胎儿成熟红细胞并与红细胞表面抗原结合，继而致敏红细胞被单核-巨噬细胞系统破坏，发生溶血反应。二是HDFN的发生与胎儿或新生儿红细胞生成抑制有关，研究发现Kell和MNS血型系统（抗-K、抗-M）相关的新生儿溶血病主要破坏红系祖细胞，妊娠12周之前就有可能引起胎儿贫血，引起胎儿造血异常，但是不会发生红细胞代偿性增加[42-43]。

3 HDFN产前风险评估

3.1 父母血型鉴定：胎儿遗传自父系红细胞血型抗原与母体血型不合是发生HDFN的高风险因素，孕妇应在妊娠8～12周建档和孕龄28周时进行ABO和RhD血型鉴定。ABO血型不合所致的HDFN在国内最常见，通过父母血型鉴定提前评估胎儿发生HDFN的风险，对高风险人群采取预防措施。虽然ABO血型和RhD血型系统不合都与HDFN相关，但是二者同时存在时，ABO不相容性会降低D抗原免疫的风险[44]。

3.2 胎儿血型预测

3.2.1 有创基因检查：有创基因检查通过脐静脉穿刺、羊水穿刺和绒毛活检等侵入性产前诊断技术直接取样获取胎儿DNA进行胎儿血型鉴定，但是这些检查技术可能导致红细胞同种免疫、心动过缓甚至流产等严重的并发症，羊膜穿刺术后所导致的流产风险为0.3%[45-46]。目前在临床已较少应用，而无创的基因检测方法才是未来预测胎儿血型主要手段。

3.2.2 无创基因诊断（NIPT）：1997年，卢煜明教授[47]等在孕妇血浆和血清中发现了少量胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA），为NIPT的建立提供了理论基础。1998年，LO[48]等采用实时荧光定量PCR发现孕妇血浆中的cffDNA含量从第五周开始逐渐增多。SMID[49]等研究发现在分娩后2天内，105名妇女中有47名（45%）血浆中存在很低浓度的可检测的胎儿DNA，但未发现cffDNA长期存在的证据。YU[50]等通过大规模平行测序对cffDNA进行测定可精确观察到胎儿DNA在分娩后分两个阶段被快速清除，半衰期分别为1h和13h，并通过快速配对末端测序证实孕妇血浆中胎儿的DNA片段短于来自母体的DNA片段。这一系列研究说明cffDNA是临床进行NIPT的可靠标志物。FINNING[51]等在RhD阴性孕妇妊娠28周时采用自动化技术分离孕妇血浆中的胎儿DNA，通过高通量方法预测胎儿RhD表型的准确率达到95.7%。英国血液学标准委员会（BCSH）的指南中提出在妊娠≥16周或更晚时分离母体血浆cffDNA进行RhD基因分型敏感性更高[52]。CHITTY[53]等的队列研究显示在妊娠11周时足以通过胎儿DNA预测RhD类型。目前一些欧洲国家已经通过cffDNA来确定胎儿RhD血型，用于避免不必要的产前抗D免疫球蛋白（Rh immune globulin，RhIG）的使用和产后预防的指导。荷兰[54]、丹麦[55-56]、瑞典[57]、法国[58]和加拿大[59]等国家已经在临床开始实施NIPT进行胎儿血型RhD分型。

国内外对cffDNA进行RhD分型已经做了大量研究，但由于cffDNA在母体血浆中的含量极少，其性质与母体来源的DNA高度相似，目前尚无进行统一的提取方法。2020年，卢煜明教授[60]等提取了孕妇血浆中的染色体外环状DNA（eccDNA）进行检测，发现胎儿来源的eccDNA片段和cffDNA片段一样，短于母体来源的eccDNA，但是其稳定性更高，有可能会成为新一代标志物。NIPT作为无创DNA检测领域一大进步，针对RhD血型进行的研究较多，对ABO血型系统关注相对较少，如果未来想在临床普遍应用仍需要继续探索。

3.3 孕妇红细胞不规则抗体筛查：美国妇产科学院（ACOG）建议所有孕妇在第一次产前检查时进行常规筛查，以评估产妇血型（ABO）、RhD和其它不规则抗体[61]。MNS血型系统中抗-M的最佳反应温度在4℃，曾经被认为没有临床意义，不过近年来不断有抗M相关病例报道，发现其通过破坏红系祖细胞引起的HDFN伴有低再生性贫血，导致早期流产和胎儿水肿的风险增加[43]。国内外也有报道其他罕见IgG类抗-PP1Pk[62]、抗-Hr0[63]抗体引起的HDFN。目前已经报道可能引起HDFN的稀有血型系统抗体有Rh系统、Kidd系统、Duffy系统、Kell系统、MNS系统。

3.4 抗体效价监测：抗体效价监测可以反映孕妇体内抗体水平变化，提示发生HDFN的风险，但是目前国内实验室无国家标准物质对照检测，与国外存在一定差异。国内相关孕期管理中指出孕妇为RhD阴性或孕妇为O型，丈夫为非O型者在妊娠12～16周进行第一次检测，作为抗体基础水平，高效价IgG抗-A、抗-B或ABO以外抗体，建议在妊娠28周前每月进行一次抗体检测，妊娠28周至分娩前每2～4周检测一次；抗-D≤16， 每4周做一次抗体效价测定，抗体效价 ≥32， 每2周一次[64]。孕期IgG抗-A/B效价大于64时患HDFN的风险增加，应进行产前干预降低抗体效价[65]。

国外认为ABO血型系统引起严重的HDFN较少，不推荐进行抗体效价检测。英国发布的指南中指出妊娠8～12周进行第一次检测，检出抗-D、抗-c和抗-K等具有临床意义抗体时进行定量分析，妊娠2 8周前每四周一次，妊娠28周至分娩前每两周一次，胎儿娩出后立即行直接抗人球蛋白实验、血红蛋白和胆红素检测进行确诊，初次抗体筛查未检出具有临床意义的抗体的孕妇需在妊娠28周时重复抗体筛检，阴性无需处理[66-67]。国外对妊娠期抗-D的管理也进行了明确规定：检出抗-D小于4 IU/mL时进行临床观察；4～15 IU/mL提示中度HDFN；大于15 IU/mL提示重度HDFN，建议转入胎儿医学专科治疗[67]。

抗-K作为一种与严重的HDFN相关的抗体，其效价监控目前仍有争议，一般将临界值规定为32，但在效价很低时下也有可能导致严重的HDFN，英国和美国将临界值定为＜32，也有人建议应将抗-K的临界值效价定为4，孕期任何时候检测到都需及时行超声检查确定胎儿是否发生贫血和水肿[68]。其他血型系统抗体尚没有统一抗体效价阈值，但是已有37℃下效价为1的抗M引起严重HDFN的报告，因此也有人认为非ABO血型系统抗体检出就有意义[69-70]。

3.5 IgG抗体亚型鉴定：孕期IgG抗体水平不能作为HDFN发病唯一标准，有些孕妇血清中抗体效价＞1∶64或者更高时，胎儿并未出现溶血症状。研究证实孕妇血清中IgG各亚型的含量与HDFN相关，目前国内主要通过流式细胞术和ELISA进行IgG抗体亚型鉴定，但是这两种检测试剂价格昂贵且操作时间长，不利于临床推广。近几年有人提出采用微柱凝胶技术进行IgG抗体亚型鉴定的实用性更强，但是其敏感性有待提高[71-72]。

3.6 抗体活性鉴定：抗体筛查和抗体效价检测是临床预测发生HDFN风险的常见方法，但是这些方法只能证明体内存在抗体并不能反映抗体免疫活性。进一步的抗体活性鉴定可以预测可检测的红细胞同种抗体的临床意义，主要包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 （antibody-dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC）实验和单核细胞单层测定（monocyte monolayer assay，MMA）[73-74]。红细胞的破坏程度与抗体活性密不可分，之前的研究证实单核细胞相关的ADCC是预测红细胞破坏最敏感的实验方法[75]。MMA可以模拟人体内免疫反应，直观地反应致敏红细胞被单核细胞吞噬情况[76]，对预测体内低效价的抗体是否导致HDFN具有指导意义。

3.7 超声检查：胎儿大脑中动脉多普勒评估是预测胎儿贫血的最佳无创工具，胎儿贫血时由于血液粘稠度降低，MCA-PSV速度增快[77]。胎儿保持平静状态下，于大脑中动脉起始部测量可以避免MCA-PSV的中位数倍数（multiple of the median， MoM）测值过高。目前国际上主要采用MARI[78]等制定的参考标准：MCA-PSV=1.0 MoM为妊娠时正常平均值；MCA-PSV＞1.5 MoM时胎儿存在中高度贫血风险，每2～3天复查一次；MCA-PSV持续＞1.5 MoM时，需行脐静脉穿刺采样检查，必要时行宫内输血治疗；高危孕妇（抗-D、抗-c 和抗-K的效价高于风险临界值）从孕16～18周开始每周复查。超声检查方法除监测MCA-PSV外，还能更加直观地观察胎儿水肿、肝脾大及羊水量和生长发育状况。

4 总结 综上所述，红细胞破坏主要与胎母血型不合所引起的抗原抗体反应以及破坏胎儿红系祖细胞有关，溶血反应的严重程度与红细胞同种抗体的特异性、功能活性以及抗体靶向抗原在胎儿红细胞上的表达相关。父母血型鉴定、孕期抗体筛查、ADCC、MMA和MCA-PSV都有利于进行风险评估，基于cffDNA的NIPT可以预测RhD血型，减少不必要的RhIG应用同时避免了侵入性操作可能造成的并发症。机体免疫状态在红细胞免疫过程中发挥十分重要的作用，尽管多种免疫分子已经证明与红细胞同种免疫有关，但是与红细胞同种抗体产生相关的作用机制尚未完全阐明。孕妇妊娠过程中的免疫状态调节是否是诱发HDFN的关键因素，有待进一步研究。

利益冲突作者声明不存在利益冲突