韩海燕，许铭娟，姬利红

（河南省鹤壁市人民医院药学部，河南 鹤壁 458030）

颅脑创伤后癫痫（Post-traumatic epilepsy，PTE）是颅脑创伤后的严重并发症之一。对于颅脑手术患者围手术期预防性应用抗癫痫药物在临床已经达成普遍共识，认为其有助于降低术后癫痫的发生率，具有应用有效性[1]。丙戊酸钠（Sodium valproate，VPA）是临床上最常用的抗癫痫药物之一，是神经外科围手术期癫痫预防的首选。丙戊酸钠有效血药浓度为50～100 μg/ml，其治疗窗较窄，个体差异较明显[2]。UGT1A3、UGT1A6、UGT1A9 和UGT2B7 等酶均参与了VPA 的葡糖醛酸化过程[3]。UGT 酶对丙戊酸葡糖醛酸化的个体差异可能会影响其药理作用及生理作用，其基因多态性可影响VPA 的血药浓度[4-6]。基于此，本研究主要探讨UGT1A6（T19G）基因多态性与丙戊酸钠血药浓度的关系，以期为制定个体化的丙戊酸钠药物治疗方案提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入我院神经外科2020 年1 月—2020 年12 月围手术期预防使用丙戊酸钠患者55 例，其中男性37 例，女性18 例，年龄18—73 岁，平均年龄（33.1±19.0）岁，平均体重（54.6±19.8）kg。纳入标准[7]：①行开颅手术患者；②单药使用丙戊酸钠预防癫痫者；③年龄≥18岁者；④体重指数BMI 在18～24 kg/m2；排除标准：①联合使用可影响丙戊酸钠血药浓度等药物（如碳青霉烯类）者；②既往有癫痫病史者；③肝肾功能异常者。本研究方案经医院医学伦理委员会批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

所有患者均按医嘱使用丙戊酸钠，包括丙戊酸钠口服液（赛诺菲＜杭州＞制药有限公司，批准文号：国药准字H20041435，规格：300 ml ∶12 g），丙戊酸钠片（湖南省湘中制药有限公司，批准文号：国药准字H43020874，规格：0.2 g），连续服用丙戊酸钠5 个半衰期后（约100 h，距最近一次口服药物8～12 h），于次日晨起给药前30 min 空腹采集静脉血3 ml，放置于不加抗凝剂管中，用于丙戊酸钠血药浓度测定，另采集静脉血3 ml 置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中（短期-20℃保存，长期-70℃保存）用于提取DNA。

1.2.2 血药浓度检测

所采集血样置离心机中，以离心半径8.6 cm，转速3 000 r/min，离心10 min，取上层血清200 μl 加入VPA试剂盒（德国西门子公司），使用Viva-E 型全自动药物浓度分析仪（德国西门子公司），采用酶免疫法测定丙戊酸钠血药浓度。

1.2.3 基因型检测

按照DNA 提取试剂盒（美国OMEGA 公司）上说明步骤提取DNA，特异性PCR 引物均由北京六合华大基因科技有限公司设计合成（表1）。PCR 扩增反应体系包括：DNA 1 μl，缓冲液（10×PCR）3 μl，MgCl2（25 mmol）3 μl，dNTP（10 mmol）0.6 μl，引物（10 μmol）1 μl/条，Taq 酶（5 u/μl）0.6 μl，加H2O 至15 μl。PCR反应条件：94℃预变性5 min 后，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，总共35 个循环后，72℃再延伸5 min。纯化条件：37℃ 20 min，80℃失活15 min。PCR 扩增产物检测采用琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：电压110 V，电流75 mA。40 min 后观察结果，要求PCR 扩增产物为单一、清晰的条带。满足上述要求后，则进行SNaPshot 延伸反应。

表1 UGT1A6 (T19G) SNP 位点PCR 引物序列

SNaPshot 延伸反应体系：纯化后的PCR 产物1 μl，SNaPshot Mix 试剂0.5 μl，延伸引物（10 μmol）0.2 μl/ 条，加H2O 至5 μl。反应条件：94℃预变性1 min 后，94℃变性10 s，52℃退火5 s，60℃延伸30 s，总共35 个循环，最后72℃延伸3 min。取1 μl延伸产物，加9 μl 上样甲酰胺，96℃变性3 min，立即冰水浴等待测序。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 19.0 统计软件进行分析，计量资料均采用（±s）表示，采用t检验或单因素方差分析；计数资料以（n）或（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UGT1A6（T19G）基因型及其分布

UGT1A6 关键SNP 位点T19G，其基因频率符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05），见表2。

表2 UGT1A6(T19G)基因型频率分布（n，%）

2.2 不同基因型患者基本情况对比

不同基因型患者性别、年龄、体重、日剂量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 不同基因型患者基本情况比较（n，±s）

表3 不同基因型患者基本情况比较（n，±s）

基因型性别年龄（岁） 体重（kg） 日剂量（mg/kg）男女TT 22 12 34.1±18.0 55.8±19.5 17.05±5.58 TG 11 4 30.2±21.7 51.4±17.8 17.98±2.65 GG 4 2 31.0±19.0 49.7±27.6 18.48±7.11

2.3 基因多态性与丙戊酸钠血药浓度相关性分析

55 位患者的平均血药浓度为（70.62±24.72）μg/ml，其中2 例患者血药浓度＞100 μg/ml，3 例患者血药浓度＜50 μg/ml。UGT1A6（T19G）突变基因携带者TG/GG 丙戊酸血药浓度显著低于野生纯合型TT 丙戊酸血药浓度，差异有统计学意义（F=6.015，P=0.003），见表4。

表4 UGT1A6（T19G）基因型与血药浓度关系[（±s），µg/ml]

表4 UGT1A6（T19G）基因型与血药浓度关系[（±s），µg/ml]

基因型 标准化血药浓度 血药浓度TT 3.76±0.92 75.83±22.01 TG 4.10±0.97 65.82±21.57 GG 5.64±0.88 63.63±27.08

2.4 基因多态性与不良反应之间的关系

55 位患者中有3 例发生胃肠道反应（恶心、腹痛），基因型分别为1 例TT、2 例TG，另有2 例发生肝功能异常（转氨酶升高），基因型均为TT。5 例中仅1 例肝功能异常者血药浓度＞100 μg/ml，余血药浓度均正常。

3 讨论

VPA 的给药剂量往往难以预估，部分患者低给药剂量时可出现血药浓度仍超过有效血药浓度情况。因其不良反应与血药浓度有一定关系，血药浓度大于100 μg/ml 可能会引起严重的肝毒性及血液系统的不良反应，故使用VPA 时需监测血药浓度。鸟苷酸二磷酸葡糖醛酸转移酶（Uridinediphosphate glucuronosyl transferase，UGT）是生物体内外源性物质进行Ⅱ相生物转化主要的代谢酶。VPA 在进入人体后，约各有40%～50%的VPA 分别经UGT 和线粒体β-氧化代谢。丙戊酸通过UGT 酶代谢成丙戊酸葡糖苷酸，经肾脏排泄[8]。UGT1A6(T19G)位点较新，其基因位点有GG、TT、TG 三种基因多态性。近年来有研究表明，UGT1A6 基因突变可以影响丙戊酸的代谢。因此，了解UGT1A6 基因多态性与丙戊酸钠血药浓度的关系对制定个体化的丙戊酸钠药物治疗方案具有重要意义。

3.1 基因型分布频率分析

在丙戊酸Ⅱ相代谢中，最主要的酶为UGT 酶，编码UGT 酶的基因有2 个家族UGT1、UGT2，UGT1 中UGT1A6 和UGT1A9 基因在人肝组织中高表达，其基因多态性可影响丙戊酸钠血药浓度[9]。本研究通过对UGT1A6（T19G）进行多态性分析，得到患者UGT1A6（T19G）位点的基因频率分别为75.46%、24.54%，通过Hardy-Weinberg 遗传平衡检验表明研究资料具有群体代表性。其基因突变率为24.54%，与文献报道的亚洲人群的23.80%接近[10]，可信度较高。此外，本研究发现各基因型患者性别、年龄、体重、日剂量均无统计学差异，提示基因型分布与临床特征无明显相关性。

3.2 基因型对血药浓度的影响

本研究结果表明，基因位点UGT1A6（T19G）不同基因型可影响VPA 血药浓度。本研究中55 例入组患者均服用常规剂量VPA，其中2 例血药浓度超安全范围，基因型均为野生纯合型TT，可能与UGT1A69（T19G）基因突变导致其代谢所需酶活性增高，导致丙戊酸从体内清除加快有关[10]，因而突变型基因患者可能需要更高剂量以达到有效血药浓度。因VPA 药物疗效与血药浓度呈相关性，VPA 超安全治疗范围，其不良反应发生率可能提高[11]。通过本研究可知，UGT1A6（T19G）其野生纯合型TT 基因携带者血药浓度要显著高于其突变型TG+GG 基因携带者，建议基因型TT 的患者服用VPA 时可酌情减少给药剂量，基因型为TG 或GG 的患者服用VPA 时可遵循说明书用量或酌情增加剂量。

3.3 基因多态性与不良反应分析

VPA 常见不良反应有肝功能异常、胃肠道反应、神经系统症状等，其中肝功能异常发生率最高，可达15%～30%[2]。有文献报道[12]，VAP 肝毒性与CYP2C9酶活性有关，但与UGT 酶活性相关性尚无报道。本研究中55 例患者中发生不良反应者5 例，2 例为肝功能异常，总体来看不良反应发生人数较少，且基因型包含TT、TG。但目前关于UGT1A6（T19G）不同基因型对不良反应的影响不明确，有待扩大样本后进一步研究。

3.4 总结与不足

影响VPA 患者血药浓度的因素是多方面的，包括VPA 的剂型、给药剂量、正确的采血时间、基因多态性及药物相互作用等。本研究排除药物相互作用及给药剂量超说明书等因素，但不排除采血时间的差异等人为因素。若同时给予同一生产厂家同一剂型药品，同一时间采血，患者血药浓度仍差异较大，则可能为基因多态性影响其血药浓度。另该研究样本量有限，不良反应发生例数少，UGT1A6（T19G）基因多态性对VPA 血药浓度及不良反应的影响仍需扩大样本进一步研究。

综上所述，UGT1A6（T19G）基因多态性影响患者丙戊酸钠血药浓度，其基因突变携带者可能需要更高剂量的丙戊酸钠。