刘欢，李亮

1. 上海工微所科技有限公司（上海 200233）；2. 上海冠生园蜂制品有限公司（上海 201419）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质[1]。蜂蜜气味香甜、口感润滑并且具有较高的营养价值。蜂蜜风味能够直观地反映出蜂蜜的品质特性，而其特有风味的形成依赖于多种挥发性化合物的协同作用，尤其是一些气味阈值较低的化合物。目前蜂蜜中挥发性化合物的研究方法已较为成熟。挥发性化合物被从蜂蜜中萃取出来后，通常运用配有检测器的气相色谱仪（Gas chromatography，GC）进行化合物的分离鉴定，或者运用感官分析对蜂蜜风味进行具体描述[2]。萃取分析直接影响蜂蜜中挥发性成分的提取效率和鉴定结果，是后续进行蜂蜜分析和评价的基础。主要从萃取分析技术等方面综述近年来蜂蜜中挥发性化合物的研究成果，旨在为蜂蜜挥发性化合物的研究提供理论参考。

1 萃取技术

溶剂萃取和顶空萃取是分析挥发性化合物常用的萃取技术。溶剂萃取使用有机溶剂萃取蜂蜜中的挥发性成分，操作繁琐且容易造成环境污染。顶空萃取则避免了有机溶剂的使用。

1.1 溶剂萃取

液液萃取（Liquid-liquid extraction，LLE）是最基本的溶剂萃取技术，非极性或弱极性的二氯甲烷[2]和乙醚[3]等有机溶剂通常用来萃取蜂蜜中的挥发性化合物。同时蒸馏萃取（Simultaneous steam distillation-solvent extraction，SDE）和超声波辅助萃取（Ultrasoundassisted extraction，USE）则是在LLE的基础上分别结合水蒸馏法和超声波法，以提高萃取效率。王兴龙等[4]分别利用LLE、SDE和USE方法萃取油菜蜜中挥发性成分。结果显示，LLE结果中的化合物数量最少（28种），SDE和USE则分别有36种和48种。但是，这3种方法对样品的多次重复萃取，造成有机溶剂使用量的增加[3,5]。固相萃取（Solid phase extraction，SPE）可以集样品净化和富集于一体，首先使用预处理后的萃取柱吸附蜂蜜中的目标化合物，然后使用少量的有机溶剂洗脱。萃取柱中填充的吸附材料种类多样，梁芳慧等[3]对比分析了HLB柱、LC-C18柱和LC-C4柱对蜂蜜中挥发性成分的萃取效果。结果显示，亲水性HLB柱萃取到47种化合物，基本涵盖了LC-C18柱和LC-C4柱萃取的化合物。Jasicka-Misiak等[6]在分析菊科蜜时使用的是SDBL柱；Uckun等[2]分析柑橘和黄芪蜜时使用的是OASIS柱。

1.2 顶空萃取

顶空萃取是分析挥发性化合物常用的方法，在密闭的容器中，一定温度下化合物从蜂蜜中挥发出来后被捕集装置捕获。捕集装置可以是气体针、填充或涂覆有吸附材料的吸附管、不锈钢丝或者搅拌棒等。静态顶空（Static headspace extraction，SHS）是利用气体进样针抽取蜂蜜上方气体并直接进样到GC中的技术。Arroyo-Manzanares等[7]鉴定蜂蜜掺假时，称取1 g蜂蜜放入20 mL顶空瓶并最终抽取750 μL气体进行检测。王文静等[8]判别蜂蜜蜜源时，称取13 g蜂蜜并且进样体积为1 mL。动态顶空（Dynamic headspace extraction，DHS）又叫吹扫捕集，其利用大流量高纯气体吹扫蜂蜜上方气体，同时填充有多孔聚合物的吸附管（通常为Tenax TA）选择性地吸附挥发性化合物[9]。Escriche等[10]运用DHS分析薰衣草蜜和百里香蜜时，使用100 mL/min的氮气吹扫样品并使用Tenax TA吸附管捕集挥发性成分。Patrignani等[11]则使用30 mL/min的氦气吹扫阿根廷蜂蜜。

固相微萃取（Solid-phase microextraction，SPME）是将涂覆有吸附材料的探针插入样品上方气相，一定时长的萃取过后，将探针拔出并直接插入GC进样口脱附的技术。SPME在蜂蜜挥发性成分的研究中被广泛应用。Karabagias等[12]对不同产地柑橘蜜的SPME分析中，萃取条件分别为探针涂层DVB/CAR/PDMS（Divinylbenzene/Carboxen/polydimethylsiloxane）、萃取温度45 ℃、萃取时间30 min、平衡时间15 min、样品量2 g和氯化钠0.2 g。结果共检测出33种化合物，其中总挥发物含量顺序为摩洛哥＞希腊＞埃及＞西班牙。王桃红等[13]运用SPME分析了60 ℃时14个成熟度不同（波美度35.6-42.0）的荞麦蜜。结果共检测出168种挥发性化合物，其中酯类和醇类在成熟度低的荞麦蜜中含量较高，而醛类和酸类含量在成熟度高的荞麦蜜中较高。此外，枣花蜜、刺槐蜜以及百花蜜等多种类蜂蜜的SPME分析也都有报道[14-16]。作为SPME的一种衍生技术，Cacho等[17]使用涂覆了吸附材料的搅拌棒对蜂蜜中的单萜类化合物进行分析。在PDMS、聚丙烯酸酯和乙二醇-硅酮三种涂层中，PDMS对芳樟醇、香叶醇、薄荷醇和桉树油的灵敏度最高。此外，在12个蜂蜜样品中，化合物的最高检测浓度达到64 ng/g。

2 分析技术

2.1 色谱分析

气相色谱质谱联用仪（GC Mass spectrometry，GC-MS）是高效分析食品中挥发性化合物的仪器。在GC进样口迅速气化的化合物随载气（高纯氦气）进入色谱柱并被分离开，之后MS检测器将其离子化并检测定性。对于蜂蜜来说，已鉴定出的挥发性化合物在40种以上[18]。Pattamayutanon等[19]利用HS-SPMEGC-MS分析不同种类的泰国蜂蜜，结果共鉴定出63种挥发性化合物，其中有32种被认为是潜在的蜜源标记物。Karabagias等[20]利用HS-SPME-GC-MS分析了柑橘蜜、冷杉蜜、松树蜜和百里香蜜四种蜜源共82个样品，并进行了多元方差分析。结果表明，莳萝醚、α-4-二甲基-3-环己烯-1-乙醛、乙酸乙酯、辛酸乙酯、邻氨基苯甲酸甲酯、2, 2, 4, 6, 6-五甲基庚烷、苯乙醛、顺式芳樟醇氧化物和丁香醛（异构体Ⅲ）等9种化合物可以有效鉴定蜂蜜蜜源。王华堂等[21]还将指纹图谱技术应用于中意蜂荔枝蜜的HS-SPME-GCMS分析，通过比对各荔枝蜜的色谱图数据，找到并建立了包含有16个共有峰的荔枝蜜挥发性成分的指纹图谱。此外，他们还针对中意蜂龙眼蜜分别建立了包含16个和15个共有峰的龙眼蜜挥发性成分的指纹图谱[22]。其他一些运用HS-SPME结合GC-MS来研究蜂蜜中挥发性化合物的文献汇总在表1中。在色谱分析中，化合物的有效分离是关键步骤，并且分离效果受到色谱柱种类的影响。蜂蜜中挥发性成分的分离通常采用非极性或弱极性的色谱柱（表1）。王桃红等[13]分析荞麦蜜时还对DB-5MS和VF-624的分离效果进行了比较。结果表明，无论是化合物峰个数还是响应值，DB-5MS均明显优于VF-624。

表1 蜂蜜中挥发性化合物的HS-SPME-GC-MS分析条件及研究内容

全二维气相色谱（GC×GC）是将两台配置了不同极性色谱柱的GC串联，并且两台GC之间安装有调制器，可以将第一根色谱柱分离后的化合物聚焦，接着传入第二根色谱柱进行分离。所有被分离组分最后进入检测器并最终得到以柱1保留时间为第一横坐标（min），柱2保留时间为第二横坐标（s），信号强度为纵坐标的三维色谱图或二维轮廓图，其中第二根色谱柱通常采用OV-1701、BPX50或各种环糊精作为固定相[40]。Špánik等[41]运用GC×GC-FID研究了蜂蜜中10种手性挥发性化合物的对映体比率，并得出结论：反式-芳樟醇氧化物的对映体比例可以用作向日葵和栗子蜂蜜的标记。该研究选用DB-FFAP作为第一根色谱柱，第二根色谱柱则根据化合物性质分别选用过甲基-β-环糊精（顺（反）式-芳樟醇氧化物、（脱氢）芳樟醇和4（α）-松油醇）和6-叔丁基二甲基甲硅烷基-2, 3-二甲基-β-环糊精（丁香醛A-D）。区别于MS检测器的离子分离原理（质荷比），离子迁移谱（Ion mobility spectroscopy，IMS）是根据离子的不同迁移时间来分离定性。HS-GC-IMS技术已被应用于蜂蜜掺假鉴定，其中色谱柱为FS-SE-54-CB-0.5或者HP-5MS UI[7,42]。火焰离子化检测器（Flame ionization detector，FID）使用氮气作为载气，其通常与GC-MS结合使用并被用于蜂蜜挥发性成分研究中的条件优化部分[43]。

2.2 感官分析

感官分析可以对食品的气味、滋味等感官属性进行定性检测和定量描述，其中描述性分析是食品感官分析领域中应用最广泛的方法。Kružík等[44]在鉴别蜂蜜掺假的研究中发现了5个可能掺假的蜂蜜样品。感官分析结果表明，这些样品具有非自然或类似糖的气味，虽然它们整体风味的评分还不错，但是令人愉悦度却比较低。感官分析还常与色谱分析结合使用来探索蜂蜜香气与化合物之间的关联性。Costa等[45]运用描述性分析和GC-MS对比了3种单花蜂蜜的风味特征。结果显示，juazeiro蜂蜜具有强烈的焦糖香气，且苯甲醛和苯乙醛可能与其特征性的风味有关系。Velame蜂蜜中酸类物质含量较高且具有丁香香气。对于juremabranca蜂蜜，其草本香气的重要贡献化合物则可能是己醇、柠檬烯、α-法呢烯和δ-卡丁烯。Siegmund等[40]运用一种快速描述性分析方法（Napping）、GC-MS和GC×GC-MS对8种蜂蜜进行对比和分类，并进行了主成分分析。结果显示挥发性化合物和感官评价的分析结果具有很高的关联性，表明Napping非常适合对单种/单花蜂蜜进行快速分类。

随着科技的进步，智能化的感官分析仪器不断被研发出来并被用于食品分析。电子鼻是模拟人体嗅觉受体开发出来的分析挥发性气味物质的仪器。它可以获得蜂蜜中挥发性化合物的整体信息，常被用来进行蜂蜜种类的鉴别和分类[46]。嗅闻仪（Olfactometry，O）通过与色谱仪器的联用，可以针对某一种挥发性成分进行气味描述，并进一步确定影响蜂蜜香气的关键性物质[47]。如敖常伟等[14]分析枣花和枣花蜜香味化合物的研究中，GC-MS-O的检测结果显示枣花的主要香气来源为具有植物果香味的酯类物质，尤其是2-甲基丁酸乙酯。此外，17种共有成分是枣花蜜具有枣花香气的主要原因。而在柑橘和黄芪蜂蜜中，苯乙醇是最有效的关键化合物并赋予蜂蜜花香气味[2]。

3 结语与展望

蜂蜜的风味特征是反映蜂蜜品质的重要指标，而特征性风味的形成主要依赖于其中的挥发性化合物。因此蜂蜜中挥发性化合物的研究受到蜂蜜研究者及生产企业的关注。挥发性化合物的研究方法主要分为两个部分：萃取分离和分析鉴定。顶空萃取有着溶剂萃取不可比拟的优势，例如避免有机溶剂的使用和不需要过多的样品处理。色谱分析和感官分析的结合使用，有利于获取更全面的蜂蜜风味轮廓。总体来说，挥发性化合物的研究技术将不断向着环保、快速、无损和高效的方向发展。目前，蜂蜜中挥发性成分的研究内容多为蜜源的鉴定和区分、蜂蜜掺假的检测以及潜在标记物的鉴定等，而很少有蜂蜜成分的周期性变化分析。挥发性成分的组成不仅包括蜂蜜自身的香气成分，还有生产储藏过程中发生的理化或微生物反应的产物。因此，蜂蜜中的挥发性成分可能成为蜂蜜品质变化的潜在指标。