黄海燕，应颖，彭勇，袁芳芳，林吉霞，陈亚慧，章鑫，罗晶，陈勇

类风湿关节炎（RA）是一种好发于40 ～60 岁女性人群的自身免疫性疾病。2004―2014 年，美国RA 患病率在0.41%～0.54%[1-2]。研究发现，Th17 细胞在RA 的发病机制中起着重要作用[3]。亦有文献报道T 细胞糖代谢紊乱与RA 发病有着密切联系[4]。转录因子c-Myc 能够促进T 细胞的活化，且是上调糖酵解中的关键酶[5]。DNA 甲基化可通过抑制基因的表达，在自身免疫病、高血压及肿瘤等多种疾病发病过程中起着重要作用[6]。因此，本研究探讨c-Myc基因启动子甲基化在RA 发病中的作用，并分析c-Myc 基因甲基化率与IL-17 水平的相关性，及两者与炎症指标的相关性，为RA 患者的早期诊断和治疗提供一种新的思路。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019 年6―12 月就诊于中国科学院大学宁波华美医院的43 例RA 患者为实验组，均符合RA的诊断标准[7]；排除：（1）合并强直性脊柱炎、银屑病性关节炎等其他风湿性疾病，（2）合并肿瘤、肝病、糖尿病等其他慢性疾病，（3）合并明显血液学指标异常，（4）感染、癌症、外伤等其他原因所导致的关节疼痛。其中RA 活动期18 例，RA 稳定期25例。另选同期来本院体检者20 例作为健康对照组。上述研究对象间无血缘关系，且本研究经医院医学伦理委员会批准，所有参受试者均签署知情同意书。

1.2 方法 记录研究对象的相关临床资料：年龄、性别、C 反应蛋白（CRP）、血沉（ESR）及类风湿因子（RF）。各抽取2 ml 外周静脉血至2%EDTA 管中保存，经1 200 r/min 离心3 min 后分离上清液血浆及血细胞，并保存于―80 ℃冰箱中。

1.2.1 c-Myc（chr8:127736502）甲基化率检测 采用QIAamp DNA 试剂盒（QIAGEN 公司，德国）提取外周血DNA，用DNA 甲基化修饰试剂盒（Zymo 公司，美国）进行DNA 的亚硫酸盐修饰。PCR 引物由PyroMark Assay Design 2.0（QIAGEN，德国）设计，由华大基因合成：上游引物序列5’-GGGAGTTTTGGGAAGGGAGAT-3’，下游引物序列（生物素）5’-ATCCCCAAATAAACAAAATAACCTC-3’，测序引物序列5’-ATTTTGTATTGGAATTTATAATAT-3’。PCR 反应体系50l：包括H2O 34.8l，5×buffer GC（KAPA）10l，dNTP（10 mmol/L）1l，上游引物（50 pmol/l）1l，下游引物（50 pmol/l）1l，DNA 模板2l，Taq 酶（5 U/l）0.2l。反应条件：95 ℃3 min，

1.2.2 血浆IL-17 水平检测 用ELISA 测定试剂盒（中国，上海桥杜生物技术有限公司，202012，96 孔）测量蛋白质水平。依照标准品顺序分别加入50l的标准品溶液，空白对照孔加入50l 的蒸馏水，其余微孔中先加样品40l 再加生物素标记的抗体10l，在37 ℃的水浴放置30 min。5 次洗板后加入50l的酶标溶液（空白对照除外），并在37 ℃的水浴放置60 min，再次5 次洗板。加入显色剂A 液50l+显色剂B 液50l，避光10 ～15 min 后加入50l 终止液。并通过酶标仪（赛默飞，VarioskanLUX）在450nm处测量每个孔的OD 值。94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，72 ℃7 min，共40循环。最后采用焦磷酸检测仪（PyroMark Q96 ID，QIAGEN 公司，德国）检测甲基化率。

1.3 统计方法 采用SPSS20.0 统计软件进行分析。偏态分布计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验；多组间比较运用Cruskal-WallisH检验，多重比较运用Mann-Whitney U 检验。相关性分析采用Spearman相关性分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组一般资料比较 RA 活动期男4 例，女14例；平均年龄（57.7±12.5）岁。RA 稳定期男6 例，女19 例；年龄（52.6±10.6）岁。健康对照组男5 例，女15 例；年龄（54.7±11.4）岁。3 组性别比及年龄差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。

2.2 3 组c-Myc（chr8:127736502）甲基化率、CRP、ESR、RF 及IL-17 水平比较 3 组c-Myc（chr8:127736502）甲基化率差异有统计学意义（P＜0.05），健康对照组与RA 活动期和稳定期差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。3 组IL-17 水平差异有统计学意义（P ＜0.05），RA 活动期CRP，ESR，RF 与稳定期差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表1。

表1 3 组c-Myc(chr8:127736502)甲基化率、CRP、ESR、RF、IL-17 水平比较

2.3 c-Myc（chr8:127736502）甲基化率、IL-17 与各指标的相关性分析 c-Myc（chr8:127736502）甲基化率与IL-17 呈负相关性（r=－0.186，P ＜0.05）；c-Myc（chr8:127736502）甲基化率与CRP、ESR 及RF无明显相关性（均P ＞0.05）；IL-17 与CRP、ESR 及RF 有相关性（r=0.326、0.401、0.212，均P ＜0.05）。

3 讨论

c-Myc 基因位于人类第8 号染色体上，由3 个外显子和2 个内含子组成，能促进细胞增殖及诱导细胞凋亡。有研究表明，该基因编码的c-Myc 转录因子在乳腺癌、宫颈癌、肾癌、肝癌及胃癌等肿瘤组织中均表达增加，与多种抗肿瘤药物抑制肿瘤的增殖和转移过程密切相关[8]。亦有文献报道，在RA 和骨关节炎患者的成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）中发现c-Myc 甲基化水平存在差异[9]。本研究发现，不管是活动组还是稳定组的RA患者，c-Myc基因甲基化率均低于健康对照组；而RA 活动组与稳定组无明显差异。这说明转录因子c-Myc 可能参与了RA 的致病过程，但与疾病的活动性无关。

IL-17 是Th17 细胞的效应分子，能协同IL-1、TNF- 产生下游炎症因子，如IL-6 及IL-8，参与RA的炎症反应。IL-17 还通过诱导破骨细胞生成、滑膜成纤维样细胞表达RNAKL，参与骨破坏的发生[10]。本研究RA患者外周血中IL-17 水平明显高于健康对照组，且RA 活动期高于稳定期。相关性分析发现：外周血中IL-17 水平与c-Myc（chr8:127736502）甲基化率呈负相关，与炎症指标如CRP、ESR 及RF 呈正相关。这表明IL-17 参与了RA 的炎症过程，且与活动性有关，可能成为临床监测RA 活动性的一个指标。

Kunkl 等[11]在多发性硬化症患者中发现，CD28 通过转录因子c-Myc 增加CD4+T 细胞中的葡萄糖转运蛋白（GLUT1），从而上调T 细胞的糖酵解。本研究中c-Myc基因甲基化水平在RA患者中较低，可能增加了c-Myc 转录因子的水平，促进了T 细胞的活化，激活了糖酵解的关键酶，促使IL-17生成，从而导致RA的发生。

本研究的不足之处：样本量较少，且来源于同一个中心，未检测转录因子c-Myc的水平，亦未对糖酵解相关的关键酶及产物进行检测。有待进一步扩大样本量，完善以上实验，探讨c-Myc 基因甲基化在RA 发病及疾病发展中的作用。