李思佳 熊晓琦 李海涛 胡 勇 宋新宇

(1. 三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 呼吸与危重症医学科， 湖北 宜昌 443003; 2. 三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 介入放射科， 湖北 宜昌 443003)

据2019年中国肿瘤数据显示，肺癌是中国居民死亡的主要原因。杨家钰等[1]调查研究发现，肺癌已成为湖北省居民恶性肿瘤的首要死因。其中，小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)约占肺癌的15%，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌的85%。虽然临床上诊断出SCLC的占比较少，但其分化程度极低，且与NSCLC相比，发生血行转移更早，预后更差[2]。虽然SCLC对化疗敏感，但常发生多药耐药而导致化疗失败[3]。因此，开发疗效好、副作用小的SCLC治疗药物具有重要意义。最早由猪肺组织中提取的小分子化合物2-(1’H-吲哚-3-羰基)噻唑-4-羧酸甲[2-(l'H-indole-3'-carbonyl-thiazole-4-carboxvlio acid methylester，ITE]是色氨酸的代谢产物，具有很强的抗肿瘤活性[4]。同时，ITE是人体内源性小分子化合物，用于人体治疗的相对安全性高。

肿瘤是由一小部分异型性肿瘤细胞不断增殖、自我更新和分化发展而来，无限增殖、侵袭、转移和复发是肿瘤恶性演变的关键。八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4，Oct4)是干细胞的重要转录因子，可以调控多种肿瘤的干细胞特性，增加肿瘤的耐药性以及增殖和迁移能力[5]。Oct4 由POU5F1基因编码，通过结合八碱基的保守序列“ATGCAAAT”来激活或者抑制靶基因的表达[6]。一直以来，Oct4被认为是干细胞所特异性表达。近年来研究发现，在肿瘤细胞和组织中亦可检测到Oct4基因的表达[6]。相对于在自我更新中的关键作用，Oct4在肿瘤干细胞凋亡调控中的研究较少，具体机制尚不明确。本研究拟观察小分子化合物ITE对人H446干细胞增殖的作用，并探讨其分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养及处理

NCI-H446细胞购自于ATCC细胞库，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基在37℃，5% CO2，相对湿度95%的细胞培养箱中培养。培养3～5 d，待细胞融合度达50%～60%，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，离心收集细胞。①肿瘤Sphere细胞培养：无血清RPMI 1640重悬1×106个H446细胞后采用无血清干细胞培养液(EGF 20 ng/mL；bFGF 20 ng/mL；LIF 10 ng/mL；B27 1∶50；PS 1∶100)培养。培养5～7 d可看到细胞球体形成，即Sphere细胞。②ITE处理：DMSO溶解ITE粉末配置母液，无血清干细胞培养液将母液配置为不同浓度工作液(1～80 μM)，不同浓度ITE处理H446细胞24 h。DMSO组采用无血清干细胞培养液+DMSO处理24 h，Control组采用无血清干细胞培养液处理24 h。

1.2 主要试剂及培养液

ITE(HY-19317，Med Chen Express公司)；1640培养液(12633012，Gibco公司)，胎牛血清(16140063，Gibco公司)；MTT 试剂盒(M6494，Roche 公司)；抗Oct4抗体(PA5-27194，Santa Cruz公司)；抗Bcl-2抗体(15071S，Cell Signaling Technology公司)；抗GAPDH抗体(PA1-988，碧云天公司)；抗鼠 IgG HRP-linked二抗和抗兔 IgG HRP-linked 二抗(7076和7074，Cell Signaling Technology公司)；EGF(E5036，Sigma-Aldric公司)，B27添加剂(12587-010，Gibco公司)，bFGF(PHG0266，Gibco公司)，LIF(L5283，Sigma-Aldric公司)，NuPAGE®MOPS SDS缓冲液(NP0001，Invitrogen公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 MTT法检测细胞增殖

将H466细胞以3×104个/孔接种至96孔板，每孔100 μL培养液，处理后每孔中再加入10 μL的MTT A液，37℃、5% CO2培养箱中孵育4 h，加入MTT B液，37℃、5%CO2培养箱中孵育过夜。测定每孔在595 nm波长下的吸光度值(optical density，OD)。实验重复3次，每次3个复孔。

1.3.2 免疫荧光检测

①取0.3 mL的4%多聚甲醛于室温下固定细胞20 min，0.5 mL的 PBS 洗涤细胞5 min。②0.25%的TritonX-100于室温下破膜30 min，0.5 mL的 PBS洗涤5 min。③0.5 mL的2.5%BSA封闭1 h。④取0.3 mL的一抗工作液4℃孵育过夜，0.5 mL的PBS 洗涤 5 min。⑤取0.3 mL的二抗工作液避光孵育1 h，0.5 mL的PBS 洗涤 10 min。⑥加入0.3 mL的PBS，于荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.3 免疫蛋白印迹检测

①蛋白样品以20 μL/孔上样后， 60 V电泳80 min。②以转膜海绵-滤纸-PVDF膜-胶-滤纸-转膜海绵的顺序将三明治结构置于转膜槽中，170 mA转膜2 h。③取5%脱脂奶粉室温下封闭膜 1 h。④TBST清洗3次，每次5 min，一抗4℃孵育过夜。⑤TBST清洗3次，每次5 min，二抗室温孵育1 h。 ⑥TBST清洗3次，每次5 min，ELC曝光显影并保存结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，以P<0.01为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人小细胞肺癌H446干细胞的富集

无血清干细胞液培养5～7 d，可收集到人小细胞肺癌H446富集干细胞(见图1)。

图1 人小细胞肺癌H446干细胞的富集(×40)

2.2 MTT法检测细胞活力

不同浓度ITE处理H446富集干细胞24 h后，采用MTT法检测各组细胞活力。如图2所示，与DMSO组相比，ITE处理H446富集干细胞后可以显著抑制细胞活力，其效应呈浓度依赖性。结果提示，20 μM的ITE处理24 h可降低富集干细胞活力至0.46±0.03，后续实验中均使用20 μM的ITE处理富集干细胞。

注：与DMSO组相比，**P<0.01图2 MTT法检测不同浓度ITE对H446富集干细胞活力的影响

2.3 人小细胞肺癌H446富集干细胞中Oct4蛋白的表达

收集H446亲本细胞与富集干细胞进行免疫荧光检测。如图3所示，富集干细胞中Oct4的表达较亲本细胞明显增加。

图3 人小细胞肺癌H446富集干细胞中Oct4的表达(×100)

2.4 H446亲本细胞及富集干细胞中Oct4和Bcl-2的蛋白表达

收集H446亲本细胞与富集干细胞进行Western Blot检测。如图4所示，与亲本细胞相比，富集干细胞中Oct4和Bcl-2的蛋白表达量均显著增高(均P<0.01)。

注：与亲本细胞组相比，**P<0.01图4 H446亲本细胞及富集干细胞中Oct4及Bcl-2的蛋白表达

2.5 小分子化合物ITE对H446富集干细胞中Oct4及Bcl-2蛋白表达的影响

使用20 μM ITE处理H446富集干细胞24 h后，Western Blot检测发现，与Control组相比，ITE显著下调了富集干细胞中Oct4及Bcl-2蛋白表达，差异均具有统计学意义(均P<0.01，图5)。

注：与Control组相比，**P<0.01图5 ITE对H446富集干细胞中Oct4及Bcl-2蛋白表达的影响

3 讨论

通过靶向肿瘤干细胞中富集或细胞表面特异性表达肿瘤标志物的荧光抗体，结合荧光激活细胞分选系统技术，可从各种肿瘤中分离并鉴定出肿瘤干细胞[7]。目前肺癌干细胞研究的一个重要难题是缺乏富集肺癌干细胞的有效手段[8]。探索可有效鉴定出肺癌干细胞的生物标志物，可能为肺癌患者的干细胞相关治疗提供潜在干预靶点。本研究发现，富集的人小细胞肺癌H446干细胞中Oct4的表达增加，提示Oct4可能是分离或鉴定肺癌干细胞的潜在标志物。

肿瘤细胞产生凋亡抵抗是降低化疗疗效和产生化疗耐药性的决定性因素[9]。因此，抑制肿瘤细胞产生凋亡抵抗是改善化疗效果和解决化疗耐药性的有效策略。细胞凋亡的发生受外源性刺激、促凋亡基因和抑凋亡基因共同调控。由于肿瘤可改善微环境以适应并减弱外源性配体所诱导的凋亡，因此肿瘤细胞中促凋亡基因和抗凋亡基因之间的失衡决定了细胞凋亡的发生[10]。化疗药物往往通过调控某一个靶点或信号通路以诱导肿瘤细胞凋亡，若某种或多种凋亡抑制基因过表达或促凋亡基因受到抑制，细胞凋亡将被阻断并可能诱导产生化疗耐药性[11]。在众多凋亡相关基因中，已发现与肿瘤化疗耐药性有关的包括Bcl-2、P53、Bcl-XL等[12-14]。其中，Bcl-2被认为是与小细胞肺癌产生化疗耐药性密切相关的凋亡抑制基因。Bcl-2家族可分为三个亚组，一组具有抗凋亡功能，另外两组具有促凋亡功能。其中抗凋亡基因主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1和Bcl-B等，而促凋亡基因包括Bax、Bak和Bok等[15]。研究发现，Bcl-2在小细胞肺癌中表达异常增高，临床上小细胞肺癌标本中Bcl-2阳性率也明显高于其他类型的肺癌，如鳞状细胞癌、腺癌等[16,17]。体外细胞培养研究证实，Bcl-2是抑制小细胞肺癌凋亡的主要基因，Bcl-2的表达水平影响小细胞肺癌对化疗的敏感性[17]。但也有研究发现，反义Bcl-2寡核苷酸或转染的Bcl-2仅能部分影响化疗耐药性的产生[12]。尽管如此，Bcl-2仍是解决小细胞肺癌化疗耐药性的突破点。近年来联合反义Bcl-2寡核苷酸(G3139)和化疗药物，如紫杉醇、依托泊苷进行临床研究，取得了一定的临床效果[18]。既往研究认为，肿瘤干细胞是介导肿瘤亲本细胞产生多药耐药性及影响肿瘤细胞增殖的重要因素[19]。本研究发现，与H446亲本细胞相比，富集干细胞中Oct4和Bcl-2表达均显著升高，该结果提示肿瘤干细胞可能通过上调Oct4和Bcl-2蛋白表达，从而介导肿瘤耐药性及细胞增殖。因此，下调肺癌细胞中Oct4及Bcl-2的蛋白表达可能有助于降低肺癌的耐药性，促进肺癌细胞的凋亡以提高肺癌患者的生存率。

ITE是色氨酸的代谢产物，为芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AhR)内源性的高亲和力激动剂[4,20]。ITE最早从猪的肺组织中提取，具有很强的抗肿瘤活性[2]。研究发现，小分子药物ITE结合细胞质中AhR并促进其转录，AhR在细胞核中可结合Oct4基因的启动子区，进而抑制Oct4转录，诱导肿瘤干细胞发生分化，并降低其致瘤能力[21]。研究证明，ITE可以显著抑制肝癌细胞HCCLM3和SMMC7721的增殖和迁移能力，并且可明显诱导索拉非尼耐药细胞系HCCML3R发生细胞凋亡[22]。该研究证明，ITE对肝癌细胞及其耐药细胞均具有较强的抗肿瘤作用，然而目前尚未有研究报道关于ITE对小细胞肺癌的相关研究。本研究发现，ITE可显著抑制H446富集干细胞的增殖能力，并下调富集干细胞中干细胞转录因子Oct4和凋亡抑制基因Bcl-2的蛋白表达。

综上所述，Oct4或可成为分离或鉴定肺癌干细胞的重要肿瘤标志物，Oct4及凋亡抑制基因Bcl-2或成为肺癌新的治疗靶点。ITE作为人内源性小分子物质，可显著抑制H446富集干细胞活力，并下调Oct4和Bcl-2的蛋白表达，有望成为肺癌治疗的新型靶向药物。