万 涛 姚汝铖 郑 军

(三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 肝胆脾胰外科 & 三峡大学 肝胆胰外科研究所， 湖北 宜昌 443003)

肝癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤，该肿瘤发病率较高，且中晚期肝癌预后普遍较差，而大多数肝癌患者又对传统化疗药物敏感度低[1]。顺铂(cisplatin，CDDP)是一种肝癌临床化疗较为常见的基础药物，但该药副作用大，耐药性也较明显。因此，有关CDDP与其他药物联合应用来降低肝癌患者对化疗药物的抵抗作用、减少CDDP用量以及降低不良反应已经成为目前肝癌研究中的热点。Rho激酶(Rho kinase)是一种丝氨酸或苏氨酸激酶，其主要调控细胞生物功能以及维持心肌细胞存活[2]。近年来有研究者发现该酶也参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，当应用Rho激酶抑制剂Y-27632降低该酶的表达水平后，能够有效阻断Rho信号的传导通路，降低细胞骨架中的蛋白收缩，从而有效抑制肝癌细胞的生长以及迁移[3]。然而Y-27632与常用化疗药物联用是否增强肝癌细胞的化疗敏感性尚未见报道。

本研究拟以肝癌HepG2细胞株为研究对象，分别观察Y-27632、CDDP以及两药联用对HepG2细胞增殖的影响，为Y-27632在肝癌治疗中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肝癌HepG2细胞株购买于中国上海生科院；ScienCell 1640细胞培养基、噻唑兰(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)购自北京裕恒丰科技有限公司；胎牛血清购买于深圳市瑞沃德生命科技有限公司；Y-27632购买于上海恒斐生物科技有限公司；CDDP购买于江苏豪森有限公司；ZF-288全自动化凝胶成像分析系统购买于上海金鹏分析仪器有限公司；SpectraMax iD5多功能微孔板读板机购买于美谷分子仪器(上海)有限公司；BD全系列分析、分选流式细胞仪购买于北京北嘉美仪生物科技有限公司；PI购于北京凯瑞基生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购于上海锐赛生物技术有限公司；P53、Bcl-2、Bax、β-Actin引物由上海信帆生物科技有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

复苏后的肝癌HepG2细胞采用包含10%胎牛血清ScienCell 1640细胞培养液于37℃细胞培养箱中培养，0.25%的胰酶消化并传代，取对数生长期细胞进行该实验。

1.2.2 细胞增殖抑制试验

按照5×103个/孔接种96孔培养板(总体积100 μL)。分组如下：①Y-27632组，按50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L浓度梯度给药；②CDDP组，分别按2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL浓度给药；③联合用药组，取对细胞生长影响最小的Y-27632浓度与CDDP浓度为2、1、0.25、0.5和0.125 μg/mL进行组合。每组均设置3个复孔，同时设置调零孔(只含培养液，不包含细胞)和对照组(含细胞及培养液)，当药物单用与联合用药作用24 h后，每孔再加入110 μL无血清培养液及MTT 25 μL，持续培养5 h，去除上清液，每孔加入200 μL的DMSO，摇床振荡使晶体充分溶解。采用酶联免疫检测仪测定波长490 nm处的吸光度值(optical density，OD)，每组实验重复3次后取其平均值。细胞增殖抑制率计算公式：增殖抑制率(%)=(1-实验组孔OD/对照组孔OD)×100%。

药物协同效应使用金正均的Q值计算法[4]：Q=E(A+B)/[EA+EB-EA×EB]，当计算的Q值>1.15时表明两药具有协同效应；当计算的Q值<0.85时代表两药互为拮抗；当计算的Q值位于0.85～1.15时，则表明两药为叠加作用。本公式中E(A+B)代表的是两药联用对细胞的抑制率，EA及EB则代表的是两种药物单独应用对细胞的抑制率。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

选取协同作用最强，即Q值最大的一组Y-27632、顺铂进行细胞凋亡率检测。首先制备密度为1×106/mL的悬浮细胞液，然后再接种于6孔板中培养24 h，每组离心后弃上清液，每孔加入195 μL的Annexin V-FITC结合液，重悬细胞后再加入PI 15 μL，混匀后立即检测HepG2细胞的凋亡率。结果分析：早期发生凋亡的HepG2细胞位于右下象限；晚期才凋亡的HepG2细胞则位于右上象限；坏死细胞位于左上象限；正常的活HepG2细胞不被染色则位于左下象限。

1.2.4 Western Blot

提取各实验组蛋白并定量后，取100 μg细胞蛋白样品上样，进行电泳及转膜。5%脱脂牛奶的PBST室温封闭1 h。一抗4℃孵育过夜。PBST反复清洗4次，每次5 min。二抗室温孵育1 h。PBST洗4次，每次5 min。后加入ECL底物进行反应，5 min后暗室显影，内参为β-Actin。

1.2.5 RT-PCR

培养48 h后收集HepG2细胞，采用Trizol法提取样品中的总RNA，测定适量的样品浓度、纯度，并逆转录成cDNA，于-80℃冰箱中妥善保存。取cDNA反应的原液2 μL，焦磷酸二乙酯水39 μL，dNTP 1 μL，10×PCR buffer 5 μL，上下游引物各1 μL(具体引物序列见表1)，Taq聚合酶1 μL，总体积为50 μL。PCR的作用条件：94℃预变性4 min，58℃(P53)35 s、55℃(Bax)35 s、60℃(Bcl-2)35 s，总计30个循环，72℃延伸6 min。PCR扩增的产物使用电泳分离，以β-Actin作为内参，使用凝胶成像系统分析后得到目的基因以及β-Actin的灰度值，测得比值为目的基因的相对表达量。

表1 PCR扩增引物序列及退火温度

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 MTT法测定肝癌细胞的增殖抑制率

不同浓度的Y-27632(3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)和CDDP(0.125、0.25、0.5、1、2 μg/mL)作用于肝癌HepG2细胞，均产生较明显的体外抑制作用，其抑制率呈剂量-时间依赖关系(P<0.05)(见图1)。

图1 Y-27632和CDDP对HepG2细胞的增殖抑制作用

2.2 Y-27632与CDDP联用对肝癌细胞增殖的影响

选取对肝癌HepG2细胞影响较小的Y-27632药物浓度3.125 μmol/L(抑制率<10%)，与CDDP联用，对肝癌细胞的抑制率均明显高于单独用药组(均P<0.05)。并且联合两种药物时，Q值>1.15(见表2)。

表2 Y-27632与CDDP联用对肝癌细胞的抑制率

2.3 Y-27632与CDDP联用对肝癌细胞凋亡的影响

选取Q值最大的联合用药组，即Y-27632和CDDP浓度分别为3.125 μmol/L和0.5 μg/mL，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。单用Y-27632对肝癌HepG2细胞的凋亡影响不明显(1.55±0.44)%，CDDP可明显促进HepG2细胞凋亡(17.3±1.32)%；两药联用时，凋亡更明显(21.25±1.50)%，差异均有统计学意义(均P<0.05)(见图2)。

图2 流式细胞仪检测Y-27632与CDDP联用对HepG2凋亡的影响

2.4 Y-27632与CDDP联用对肝癌细胞Bax、P53、Bcl-2蛋白表达的影响

与对照组相比，Y-27632对Bcl-2的表达影响较小，但是能够明显增加P53和Bax的表达；CDDP能够增加P53和Bax的表达，降低Bcl-2的表达；Y-27632与CDDP联用后，P53和Bax上调、Bcl-2下调的效应更加明显(见图3)。

图3 Y-27632和CDDP联用对P53、Bax及Bcl-2蛋白表达的影响

2.5 Y-27632与CDDP联用对肝癌细胞P53、Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响

培养48 h后，各组肝癌HepG2细胞P53、Bax、Bcl-2 mRNA的相对表达量见表3。与对照组相比，其余三组P53和Bax mRNA均上调，Bcl-2 mRNA下调，联合用药组较单独用药组效应更明显(均P<0.05)。

表3 各组肝癌细胞Bax、P53、Bcl-2 mRNA比较

3 讨论

肝癌由于恶性程度高，早期易转移，切除后易复发等因素，导致其死亡人数逐年递增[5]。故抑制肿瘤的生长，防止肿瘤转移，提升患者远期预后成为亟需解决的临床问题。从肝癌治疗方面来看，由过去的手术+传统化疗药物的治疗方法转变成手术+分子靶向药物+传统化疗药物的综合治疗策略[6]。恶性肿瘤的靶向治疗已然成为近年来临床治疗方案中新的突破口。而选择一个精准的分子靶点，成为诸多恶性肿瘤安全而有效治疗的关键。

Rho激酶是近些年来广泛认可的一种与肿瘤关系密切的分子靶点。研究表明，Rho激酶主要通过磷酸化作用于下游靶分子，从而引起细胞周期的改变，并且能够明显促进恶性肿瘤细胞粘附、迁移及浸润[7]。Jeong等[8]发现，Rho激酶在卵巢癌细胞中高表达，当应用Rho激酶抑制剂Y-27632抑制该酶的表达后，肿瘤细胞凋亡率升高的同时卵巢癌细胞的迁移能力也明显下降。本研究使用Y-27632处理肝癌HepG2细胞后发现，HepG2细胞的增殖明显受到抑制，且呈剂量-时间依赖关系。该结果与Takeba等[9]使用Y-27632显著抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的结果相吻合。CDDP在临床中常被用于恶性肿瘤的化疗，但该化疗药具有严重的全身毒副作用，并且对于大部分恶性肿瘤不敏感。有文献报道Rho激酶在肝癌中的表达明显高于正常肝组织，当敲低Rho激酶的表达后，肝癌细胞的生长被显著抑制，而凋亡的发生率却明显升高，同时还能增加肝癌对CDDP治疗的敏感性[10，11]。本研究结果显示，当使用Y-27632联合CDDP处理肝癌HepG2细胞后，协同效应Q值均大于1.15，这表明两药联用可产生协同效果。另外，还发现Y-27632单独用药效果并不明显，但两种药物联合处理诱导HepG2细胞凋亡的能力明显增强。这表明Y-27632和CDDP联用可通过促进肿瘤细胞凋亡和抑制其增殖发挥协同抗肝癌的作用。提示Rho激酶靶点抑制剂Y-27632和CDDP联合使用时，能够有效地提高肝癌对化疗药物的敏感性，降低化疗抵抗，提升治疗效果。

细胞凋亡是细胞的程序性死亡，而大多数恶性肿瘤对化疗药物耐药的关键原因是其对凋亡的抵抗，调控凋亡信号通路是提高肿瘤治疗水平的关键。P53和Bcl-2均是调控恶性肿瘤细胞凋亡过程中的关键蛋白。P53主要通过Bax/Bcl-2信号蛋白发挥肿瘤细胞凋亡的调控作用。P53除了促进细胞凋亡，也是细胞周期检查点蛋白，与DNA损伤后修复密切相关。研究表明，Rho激酶抑制剂Y-27632通过促进P53和Bax蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达来诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡，抑制其增殖，从而发挥体内抗乳腺癌作用[12]。Bax、Bcl-2则可通过线粒体上的相关离子通道，与细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)相互作用，调控Cyt C从细胞内的释放，从而调控细胞凋亡[13]。有研究发现，在肿瘤细胞中Rho激酶功能的发挥主要通过调控P53、Bax及Bcl-2表达而实现[9,14]。本研究结果显示，Y-27632与CDDP联用可诱导P53、Bax表达含量显著增加，而Bcl-2的表达含量明显降低。

综上所述，Rho激酶抑制剂Y-27632能够安全且高效的抑制肝癌HepG2细胞的增殖，当与CDDP联合用药时，不仅增殖抑制效果更加显著，还能促进凋亡，且具有协同效应，该作用机理与P53上调Bax、下调Bcl-2有关。因此，Rho激酶抑制剂Y-27632能够显著提高肝癌HepG2细胞株对CDDP的化疗敏感性。