拜小强，袁肇方，牛宇辉，张向博，魏锁成

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生物医学研究中心，甘肃 兰州 730030)

0 引言

碳酸饮料(Carbonated beverages,CB)为酸性饮品，主要成分为碳酸水、柠檬酸、糖和咖啡因.随着消费量的增加，碳酸饮料已成为影响人体健康的重要因素之一[1].肥胖、II型糖尿病和代谢综合征患病率的增加均与CB大量饮用有关[2].已有研究证实，咖啡因(包括咖啡、可可和巧克力)会对生殖产生不良影响，雌性Sprague-Dawley大鼠饮用可口可乐30、39和55周后体重增加[3].大量的研究调查了咖啡因摄入是否影响女性生育能力，但这些研究大多采用回顾性方法收集数据，结果是基于问卷调查、临床病例前瞻性分析或流行病学观察获得的，结果难免存在偏差和出入[4-5].此前关于生育能力和碳酸饮料摄入量的定量评估报道较少，饮用碳酸饮料是否会导致女性不育的发生尚不明确[6-8]，相关实验研究缺乏[9-10].本文旨在比较不同剂量可口可乐和百事可乐对子宫发育及促卵泡激素受体(FSHR)蛋白表达水平的影响，为进一步研究CBs对人类生殖疾病的作用及机制提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 实验动物

28日龄昆明雌鼠150只，购自兰州大学实验动物中心[许可证号：SCXK(甘肃)2005-0007].体重20.44±2.45 g，随机分为5组(n=30)：可口可乐1组(COC-1)、可口可乐2组(COC-2)、百事可乐1组(PEP-1)、百事可乐2组(PEP-2)和对照组(CG).将小鼠分组饲养于装有自动饮水机的鼠笼中，环境条件：室温22～24 ℃，相对湿度30%～50%，光照12 h/天，提供足量的饲料(购自兰州泰华饲料有限公司)，经7 d饲养调整期后进行正式实验.

1.2 实验动物处理及样品收集

5 L瓶装的可口可乐和百事可乐购自兰州市便利超市，保存于室温(22±3 ℃).COC-1/COC-2、PEP-1/PEP-2和CG组小鼠分别自由饮用可口可乐、百事可乐和自来水，50%可乐由原装可乐加入等体积自来水稀释而成；100%可乐为原装可乐未稀释，见表1.

表1 雌鼠碳酸饮料饮用剂量

雌鼠饲养0、5、10、15、20和25 d时，每组随机抓取5只用真空采血管眼眶采血，肌肉注射0.1 mg/kg甲苯噻嗪麻醉后，颈椎脱臼法处死，采集子宫称重.血样室温下静置2 h后3000×g离心20 min，-20 ℃保存.

1.3 子宫重量的称量

雌鼠饲养0、5、10、15、20和25 d时采集子宫样品，使用电子天平称量.

1.4 子宫组织学观察及UWT测量

用10%甲醛溶液固定子宫样品，石蜡包埋后5 μm切片，苏木精-伊红染色后制得切片.在光学显微镜(Leica,Japan)和电子显微镜(JEOL,Tokyo,Japan)下观察切片，拍摄显微图像.每个样品取5个部位，每个部位取5个位点，每组共计检测125个位点，使用Image Advanced 3.2和Image Pro-Plus 2.0 (MOTIC Company,Hong Kong,China)测量子宫壁厚度(Uterine wall thickness,UWT).

1.5 Western blot检测FSHR蛋白表达

采用蛋白免疫印迹法(Western blot)分析可乐对雌鼠子宫FSHR蛋白表达水平的影响.子宫样品在含有蛋白酶抑制剂(1 mmol/L PMSF)的裂解液(0.5% Nonidet P40,10 mmol/L Tris,pH 7.4,150 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1mmol/L Na3VO4)中裂解.用10% SDS-PAGE凝胶蛋白电泳，转移至PVDF膜上，在含1×TBS(10 mmol/L Tris,pH 7.5,100 mmol/L NaCl)和0.1%Tween-20的5%(w/v)脱脂奶粉中封闭2 h，加入兔抗FSHR多克隆抗体(Sigma，1∶200)和β-actin多克隆抗体(1∶1000)孵育混合液4 ℃过夜，然后加入二抗(1∶2000)孵育1 h.使用化学发光试剂(SuperSignal West Pico,Rockford,IL,USA)进行印迹，使用Quantity One软件(Bio-Rad Company,Hercules,CA,USA)测定条带图像积分光密度值(IOD).FSHR蛋白的相对含量表示为FSHR与β-actin灰度值的比值.阴性对照组不加一抗，重复3次实验.

1.6 ELISA检测血清中FSH和LH含量

使用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒检测雌鼠血清中促卵泡激素(FSH)和促黄体激素(LH)浓度，按照产品说明书操作.用MK-3酶标仪(Rayto,USA)在450 nm波长下读取各孔的吸光度值(OD)，重复3次实验.FSH和LH检测灵敏度分别为0.02 ng/mL和0.03 IU/L，组间变异系数小于4%，标准曲线的相关系数为0.9995.

1.7 统计孕鼠妊娠期、仔鼠体重和性别

统计孕鼠妊娠期和妊娠率，计算新生仔鼠数量和性别比，每天使用电子天平称量新生小鼠的体重.

1.8 统计分析

2 结果

2.1 雌鼠体重及子宫重量

结果显示，各组间体重无显著性差异(数据略)，COC-2和PEP-2组子宫重量均低于CG组(见表2).从第15 d起，实验小鼠的子宫重量均低于CG组.第20 d和25 d，COC-2和PEP-2子宫重量显著低于CG组(P<0.05).结果表明，较长时间饮用高剂量可口可乐和百事可乐会减轻子宫重量.

表1 雌性小鼠的子宫重量(g)

2.2 子宫组织学结构

实验结果显示，对照组小鼠子宫结构清晰完整，子宫腺柱状细胞排列整齐(图1A)，子宫内膜完整，上皮细胞为分泌细胞；可口可乐组子宫腔轻微变窄，子宫壁轻度变薄(图1B)，子宫内膜上皮细胞(EEC)变短，胞浆略有减少，子宫内膜皱褶；百事可乐组子宫腔轻微变窄，子宫壁和子宫内膜明显变薄(图1C)，子宫内膜上皮细胞变少且胞浆减少，子宫内膜皱褶，子宫腔及其腺体收缩，子宫腺体分散稀少.结果表明，可口可乐和百事可乐对小鼠子宫组织结构产生影响，从而抑制子宫发育.

注：A、B、C分别代表CG、COC-2和PEP-2组.

2.3 子宫壁厚度(UWT)

结果显示，实验组雌鼠UWT小于对照组，但各组间UWT值无显著差异(数据略).结果表明，可口可乐和百事可乐对小鼠子宫壁厚度无显著影响.

2.4 子宫FSHR蛋白表达水平

实验组雌鼠FSHR蛋白表达水平较对照组均有不同程度的下降，COC-2和PEP-2组FSHR蛋白水平，在第20 d分别降低16.41%和17.20%，第25 d分别降低21.14%和22.80%(图2)，即在第20 d和25 d，COC-2和PEP-2组FSHR蛋白水平显著低于CG组(P<0.05).结果表明，可口可乐和百事可乐显著抑制子宫中FSHR蛋白表达水平.

注：1～5分别为COC-1、COC-2、PEP-1、PEP-2和CG组.

注:*与CG比较，P<0.05.

2.5 血清FSH和LH浓度

实验结果显示，第25 d，COC-1、COC-2、PEP-1组血清FSH浓度较CG组分别降低27.44%、25.58%和26.86%(图3)，均显著低于CG组(P<0.05)；第10 d和15 d，COC-2、PEP-1、PEP-2组血清LH浓度均低于CG组，15 d时PEP-1、PEP-2组差异显著(P<0.05)，表明可口可乐和百事可乐能降低血清FSH和LH浓度.

注:*与CG比较，P<0.05.

2.6 孕鼠妊娠期和仔鼠性别

结果显示，COC-2和PEP-2组新生仔鼠平均出生数较COC-1组显著减少(P<0.05)；COC-1、COC-2和PEP-2组仔鼠雄雌比例较CG组差异显著(P<0.05)；COC-2组仔鼠存活率较CG组降低显著(P<0.05)，PEP-2组仔鼠存活率较对照组降低极显著(P<0.01).此外，PEP-2组仔鼠存活率较COC-1和PEP-1组降低显著(P<0.05).各组间妊娠期无显著性差异(见表3).表明可口可乐和百事可乐能降低每胎仔鼠数量和仔鼠周龄成活率，但对妊娠期无显著影响.

表3 雌鼠妊娠期和新生仔鼠性别比例

2.7 新生仔鼠体重

实验结果显示，新生仔鼠出生体重(第0～5 d)无显著差异，而在出生后第12 d，COC-2组和PEP-2组新生仔鼠体重较CG、COC-1和PEP-1组显著增加(P<0.05).此外，COC-2组仔鼠体重在第7 d显著大于CG和COC-1组(P<0.05).结果表明，高剂量的可口可乐和百事可乐能显著促进新生仔鼠的生长发育.

表4 新生仔鼠的体重(g)

3 讨论

有文献证实碳酸饮料尤其是咖啡因影响生殖和产前产后发育[11].咖啡因的过量摄入是导致繁殖力下降的诸多因素之一，导致育龄女性的生育能力降低[11].流行病学研究调查了咖啡因摄入对生殖发育不利影响之间的联系，摄入量较高的受试者比摄入量较低的受试者生育能力降低[12].然而，咖啡因摄入导致生育能力下降的报道结果却有所不同[11]，咖啡因或含咖啡因的饮料影响生育的机制尚不明确，消费者对碳酸饮料与人类患病风险之间的关系知之甚少[12].

碳酸饮料会改变性激素水平(如雌二醇)，最终导致妊娠失败[13].本研究发现，实验组雌鼠血清FSH浓度在第5 d和第10 d略有增加，第25 d时COC-1、COC-2和PEP-1组血清FSH浓度均显著低于CG组,第15 d时PEP-1、PEP-2组血清LH浓度显著低于CG组.第20 d和25 d时COC-2和PEP-2组雌鼠子宫重量显著低于CG组，子宫壁和宫腔轻微变窄，子宫内膜上皮细胞变短，子宫内膜皱褶.实验组雌鼠子宫壁厚度(UWT值)在实验范围内低于对照组，PEP-2组子宫内膜上皮细胞变少.到目前为止，相关研究报道较少[13]，碳酸饮料(包括可口可乐和百事可乐)的准确影响效果仍有待进一步研究证实[10].

促卵泡激素(FSH)能促进腔前卵泡的增殖和分化，诱导卵泡生长和成熟[14].已有研究证实FSHR可在子宫中表达，但高剂量的可口可乐和百事可乐是否影响FSH分泌和FSHR表达尚不完全清楚[5,15].本实验中所有实验组雌鼠FSHR蛋白水平均降低，在第20 d和25 d时，COC-2和PEP-2组FSHR蛋白水平显著低于对照组.结果表明，可口可乐和百事可乐能抑制小鼠子宫FSHR蛋白的表达水平.

怀孕期间摄入咖啡因会对胎儿生长产生潜在的不利影响，但却与流行病学研究结果矛盾.一项流行病学研究表明，女性怀孕期间摄入咖啡因，婴儿出生体重低或宫内发育迟缓[15].但在本实验中，与对照组相比COC-2和PEP-2组新生仔鼠的体重在第7 d明显增加，COC-2和PEP-2组新生仔鼠第12 d体重较CG、COC-1和PEP-1组差异显著，这说明高剂量的可口可乐和百事可乐能促进新生仔鼠的生长.

综上所述，长期饮用可口可乐和百事可乐会降低子宫重量，影响子宫组织结构，血清FSH和LH浓度及子宫FSHR蛋白表达水平降低，导致子宫发育欠佳，高剂量的可口可乐或百事可乐可促进新生仔鼠的生长发育.该研究结果为进一步研究可口可乐和百事可乐对人类子宫发育和生殖功能的影响及机制奠定基础，为子宫疾病的治疗提供实验依据.