师志云，尹晓丽，王良方，侯晓惠，张玉英，李刚，王菊英，王文，贾伟

(1.宁夏医科大学总医院医学实验中心，银川 750004；2.宁夏临床病原微生物重点实验室，银川 750004；3.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004)

细胞自噬是先天免疫反应和适应性免疫反应的重要组成部分，在防御细菌感染中起着重要作用[1-2]。深入研究细菌自噬的机制及其与细胞的相互作用有助于发现细菌感染的新致病机制。肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial cells type Ⅱ, AECⅡ)与自噬的功能有相同之处，在肺脏抵御外源微生物感染中也具有重要的免疫调节作用[3]。本课题组前期建立了体外肺炎克雷伯菌感染AECⅡ模型，通过上调或抑制自噬程度进一步证实肺炎克雷伯菌能够诱导AECⅡ A549发生自噬[4]。Notch信号是进化上保守的信号级联，对细胞分化、发育和体内平衡的正常生物学过程至关重要[5]。最新研究表明，Notch信号可作为自噬的底物，参与机体自噬过程[6]。本研究通过抑制细胞自噬及Notch信号，观察肺炎克雷伯菌对肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬、Notch信号及炎症因子的影响，探讨Notch信号调控肺泡上皮细胞自噬在肺炎克雷伯菌感染中的作用机制，为进一步研究肺炎克雷伯菌的分子致病机制奠定理论基础，为临床治疗肺炎克雷伯菌提供新的线索。

1 材料与方法

1.1菌株与细胞株 肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC 700603(美国ATCC)，人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549(中科院细胞库)。

1.2试剂和仪器 TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex Taq(中国TaKaRa公司，RR820A)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(中国TaKaRa公司，RR047A)，RNAiso Plus(中国TaKaRa公司，9108)，Human INF-γ ELISA试剂盒(CSB-E04577h)、Human TNF-α ELISA试剂盒(CSB-E04740h)(中国cusabio公司)，Human IL-1β ELISA试剂盒(美国Invitrogen公司，KHC0011)，雷帕霉素(rapa)、3-甲基腺嘌呤(3-MA，美国Sigma公司)，γ-分泌酶抑制剂(DAPT，美国Sellect公司)，LC3抗体及β-actin抗体(英国Abcam公司)。……