赖呈纯 赖恭梯 车建美 黄贤贵 王琦 高慧颖 官雪芳 林斌

摘要：【目的】對福建地区葡萄自然发酵酵母菌组成的差异进行分析，明确福建主要酵母菌种类，为酿制具有南方地域特色的葡萄酒提供优良菌株。【方法】采集夏黑、刺葡萄和玫瑰香葡萄自然发酵不同阶段[发酵前期（7 d）、中期（15 d）和后期（25 d）]的发酵液进行酵母菌分离，采用WL培养基进行酵母菌表型性状鉴别，挑取代表性菌株进行DNA提取及26S rDNA D1/D2鉴定，分析不同发酵阶段酵母菌的组成差异。通过测定相同发酵条件下的酒精度、总糖、还原糖和总酸含量，对酿酒酵母的酿酒性能进行初步分析。【结果】不同品种葡萄自然发酵的发酵液中共分离获得114株菌株，根据其表型鉴定为18个不同的表型类群。进一步通过酵母菌的26S rDNA D1/D2区序列测序，可将114株酵母菌菌株划分为18种，包括拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、双孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等。不同品种葡萄发酵过程中酵母菌种类和组成具有一定的差异，其中刺葡萄A有10种、刺葡萄B有11种、夏黑A和玫瑰香均为7种、夏黑B有8种。陆生伊萨酵母（Issatchenkia terricola）出现在刺葡萄A、玫瑰香和夏黑B发酵前期，且所占比例最高，分别达100.00%、50.00%和40.00%;盔形毕赤酵母（Pichia galeiformis）是夏黑A和刺葡萄B发酵前期的优势菌;在不同品种葡萄自然发酵中期均含有泽普林假丝酵母（Candida zemplinina）和盔形毕赤酵母;刺葡萄A、刺葡萄B和夏黑B发酵后期的优势菌为盔形毕赤酵母，所占比例分别为40.00%、55.56%和71.43%;酿酒酵母在夏黑A、玫瑰香和夏黑B发酵中期开始出现，直到发酵后期，均占有较大比例，分别为66.67%、42.86%和14.29%。初步葡萄酿酒发酵表明，酿酒酵母VMH-M042的酿酒性能（酒精度12.5%、总糖含量76.0 g/L、还原糖含量40.5 g/L、总酸含量5.6%）优良。【结论】福建地区不同品种葡萄分离得到的酵母菌资源丰富，区域性差异明显，特异性资源较多，其中酿酒酵母VMH-M042在葡萄酒发酵中表现出较优良的酿酒性能，可为南方葡萄酒酿制提供丰富的菌种资源和理论依据。

关键词： 葡萄;酵母菌;自然发酵;形态特征;分子鉴定;福建

Abstract：【Objective】In order to provide good yeast strains for wine brewing with the characteristics of southern region，the difference of the yeast populations were analyzed and the main yeast species were identifiedin the spontaneous fermentation of grapes from Fujian. 【Method】The yeast strains were isolated from fermentation of Xiahei， Vitis davidiiFoex. and Muscat Hamburg at different stages[earlyfermentation stage（7 d），middle fermentation stage（15 d），later fermentation stage（25 d）]. The strains were preliminarily classified based on WL nutrient agar，DNA was extracted and 26S rDNA D1/D2 sequence analysis was conducted on representative strains. Analysis of the composition differences in yeast across the fermentation stages was conducted. The brewing performance of Saccharomyces cerevisiae was analyzed by determine the alcohol content，total sugar，reducing sugar and total acid under the same fermentation conditions. 【Result】A total of 114 strains of yeast were isolated from fermentation liquid of different varieties and preliminarily classified as 18 phenotypic groups. The 26S rDNA D1/D2 sequence analysis showed that they were identified as 18 different known yeast species，such as Zygosaccharomyces bailii， Z. bisporus and S. cerevisiae， etc. The composition of yeast populations in different stages of natural fermentation of different varieties of grapes was different. There were 10 kinds in V. davidii Foex. A，11 kinds in V. davidii Foex.B，7 kinds in Xiahei A，8 kinds in Xiahei B，and 7 kinds in Muscat Hamburg.In the early stage of the fermentation of V. davidii Foex. A，Muscat Hamburg and Xiahei B，the preponderant microzymes were Issat-chenkia terricola with the highest proportions.The proportions were 100.00%，50.00% and 40.00%， respectively. In the early stage of the fermentation of Xiahei A and V. davidii Foex.B，the preponderant microzymes were Pichia galeiformis. Candida zemplinina and P. galeiformis were involved in the middle stage of the different varieties of grapes. At the late stage of the fermentation of V. davidii Foex. A，Muscat Hamburg and Xiahei B，the preponderant microzyme was P. galeiformis，whose proportions were 40.00%，55.56% and 71.43%，respectively. S. cerevisiae was involved in both of the middle and the late stages of the fermentation of Xiahei A，Muscat Hamburg and Xiahei B. Its proportions at the late stage were 66.67%，42.86% and 14.29%. Preliminary studies of grape fermentation showed the enological characteristics（alcohol content 12.5%，total sugar 76.0 g/L，reducing sugar 40.5 g/L，and total acid 5.6%） of the S. cerevisiae strain VMH-M042 were excellent. 【Conclusion】The yeast resources isolated from different grape varieties in Fujian region are abundant with obvious regional differences and more specific resources. Among them，S. cerevisiae strain VMH-M042 has good fermentation performance. Studying on the composition and difference of yeast populations in different stages of spontaneous fermentation of different varieties of grapes from southern region can provide more yeast strain resources and lay a foundation for the local wine brewing.

Key words： grape; yeast populations; spontaneous fermentation; morphological character; molecular identification; Fujian

0 引言

【研究意义】葡萄酒的地域特色是葡萄酒创新酿制的研究主题，作为发酵主体的酵母菌对葡萄酒品质、风味和特色等均有重要作用（Alexandre，2020）。气候多样化的特点造就了丰富的葡萄酒酵母资源，每个微环境的本土酵母均具有一些独特的代谢特性，这些特性可赋予当地葡萄酒特别的风味特征（Nisiotou et al.，2019）。随着我国葡萄种植向南方区域的快速发展，从南方地区分离具有区域特色的酵母菌，对南方葡萄酒酿制和风格创新具有重要意义。【前人研究进展】酵母菌种类繁多，形态各样，酵母菌的种属描述目前以常规形态描述为主。随着分子生物学的发展，利用26S rDNA D1/D2区序列进行的分子鉴定为亲缘关系较近的不同种酵母菌鉴定提供了标准（Kurtzman and Robnett，1998;赵雪平等，2020）。26S rDNA D1/D2区序列分析表明，采用商业酵母进行的纯种发酵过程中，非酿酒酵母主要存在于发酵早期，酿酒酵母则在中后期占优势（Li et al.，2012）。对巨峰葡萄自然发酵不同阶段酵母菌的26S rDNA D1/D2区序列分析结果表明，不同发酵阶段的酵母菌最终鉴定为3个不同种，且不同种酵母菌在发酵不同阶段所占优势有所不同（张俊杰等，2017）。王志恒等（2018）采用26S rDNA D1/D2区序列分析对宁夏玉泉营地区酿酒葡萄酵母菌进行菌株鉴定，结果表明，所分离得到的22株酵母菌株鉴定为6个种，分别为葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、酿酒酵母（Saccharomyces cervi-siae）、大隐球酵母（Cryptococcus magnus）等。在多年种植葡萄的园区，成熟葡萄果实上存在着大量天然的酵母菌，这些酵母菌适应了当地的气候环境，并伴随着各地主栽葡萄品种的种植，逐渐成为优势天然酵母菌（Capece et al.，2016）。这些酵母菌在成熟葡萄的破碎过程中产生自然发酵，参与葡萄酒的酿造过程，对不同产地的葡萄酒品质和风格有着至关重要的影响（王慧等，2008;Padilla et al.，2016;徐建坤等，2019）。【本研究切入点】福建处于我国的南方区域，靠近北回归线，受季风环流和地形的影响，形成暖热湿润的亚热带海洋性季风气候，热量丰富，光照充足，年平均气温17～21 ℃，有利于葡萄生长发育和提早成熟（金光等，2006）。随着不同品种葡萄的引进和种植，福建葡萄规模化生产栽培迅速得到发展，也蕴藏着丰富独特的酵母菌资源，但目前针对福建区域葡萄自然发酵过程中可培养酵母菌多样性的研究尚未见相关报道。【拟解决的关键问题】通过WL培养基分析福建地区种植的刺葡萄、夏黑和玫瑰香等自然发酵不同阶段可培养酵母菌形态多样性，同时采用26S rDNA D1/D2区序列分析揭示自然发酵不同阶段酵母菌种群的变化动态，筛选出适合我国南方地区葡萄酒酿制的酵母菌株，以期为南方地区葡萄酵母菌株资源研究及其应用提供理论基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 样品采集 刺葡萄（冬香蕉）分别采自福建省明溪县研农生态农业有限公司葡萄园（标记为刺葡萄A）和湖南省芷江县葡萄园（标记为刺葡萄B，对照），夏黑分别采自福建省明溪县研农生态农业有限公司葡萄园（标记为夏黑A）和福建省厦门市海堤葡萄园（标记为夏黑B），玫瑰香采自福建省明溪县研农生态农业有限公司葡萄园。选择健康成熟的果实采收，用干净的自封袋密封包装，带回实验室备用。

1. 1. 2 培养基 酵母菌株分离采用YEPD培养基：酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L和琼脂20 g/L，另加100 mg/L氯霉素和25 mg/mL氨苄青霉素抑制细菌和霉菌生长。菌株的初步形态分类采用WL营养培养基：酵母浸粉5.0 g/L、酸水解酪蛋白5.0 g/L、葡萄糖50 g/L、磷酸二氢钾0.55 g/L、氯化钾0.45 g/L、氯化钙0.125 g/L、硫酸镁0.125 g/L、氯化铁0.0025 g/L、硫酸锰0.0025 g/L、溴甲酚绿0.022 g/L和琼脂17.0 g/L，pH 5.5±0.2。以上培养基均在121 ℃下灭菌20 min。

1. 1. 3 主要试剂 引物NL1（5'-GCATATCAATAA GCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTT TCAAGACGGG-3'）由铂尚生物技术（上海）有限公司合成，TaKaRa Ex Taq?DNA Polymerase购自宝生物工程（大连）有限公司，酵母菌DNA提取试剂盒（TIANamp Yeast DNA Kit）购自厦门泰京生物技术有限公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 菌株分离 将采摘的新鲜葡萄在28 ℃下发酵，于发酵前期（7 d）、中期（15 d）和后期（25 d）3个时期进行取样，共取15个发酵样品，采用无菌水依次稀释后，取100 μL均匀涂布至YEPD培养基上，置于28 ℃培养3 d，观察菌落形态，纯化并于-80 ℃保藏。

1. 2. 2 菌株形态分类 取保藏的菌株划线接种于WL营养培养基，28 ℃培养5 d后，观察并记录菌落颜色和形态。根据颜色和形态差异初步对葡萄自然发酵过程中的酵母菌株进行分类。

1. 2. 3 菌株26S rDNA D1/D2基因扩增及测序

采用酵母菌DNA提取试剂盒（TIANamp Yeast DNA Kit）进行酵母菌基因组总DNA提取。PCR扩增体系为25.0 μL：模板DNA（20 ng/μL）1.0 μL，引物NL1和NL4（10 μmol/L）各1.0 μL，dNTP混合液（10 mmol/L）0.5 μL，TaKaRa Ex Taq?DNA Polymerase（2.5 U）0.3 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 18.7 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 20 s，进行35個循环;72 ℃延伸10 min。将PCR产物送至铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。测序结果查询GenBank数据库，采用BLAST在线工具与数据库的序列进行同源性比较。

1. 2. 4 酵母菌鉴定 根据同源序列搜索结果，下载相关酵母菌菌种的26S rDNA D1/D2区序列，采用Clustal X进行匹配排列，利用MEGA 7.0中的Kimura2-Parameter Distance模型及Neighbor-joining分析法构建系统发育树，并进行1000次的Bootstraps检验。根据WL营养培养基和测序结果，每个葡萄品种在不同发酵时期只选取1株代表性菌株，共44株菌株进行聚类分析。

1. 2. 5 酿酒酵母菌产酒能力测定 选择酿酒酵母菌株VMH-M042，培养离心后获得菌体，并以安琪RV002酵母、VF、德国ERBSC?H公司生产的干酵母OFG和法国ERBSL?H公司生产的干酵母OFC酵母菌为对照，以夏黑葡萄为原料进行葡萄酒发酵，果实平均可溶性固形物为19.7 °Brix，平均总酸为0.36%。发酵工艺流程：将采收后的葡萄果实进行分选，将葡萄压榨破碎除梗形成葡萄浆醪，通过添加蔗糖将可溶性固形物调至30 °Brix，搅拌均匀后将葡萄浆醪装入已洗净消毒的玻璃罐中（装至玻璃罐体积的80%左右），一边装罐一边添加SO2（使葡萄汁中SO2含量为60 mg/L），装罐后放置20 h左右进行杀菌，随后按1∶1000（酵母粉∶葡萄汁）添加酿酒酵母，倒灌混匀后，置于恒温25 ℃下进行发酵，发酵21 d后取葡萄酒进行相关指标检测。参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定发酵后葡萄酒的酒精度、还原糖、可溶性糖和酸度等指标，初步评估各酿酒酵母的葡萄酒发酵能力。

1. 3 统计分析

采用Excel 2010整理试验数据和绘制图表，采用DPS v9.50处理试验数据，并进行方差分析。

2 结果与分析

2. 1 菌株的形态特征

从15个发酵样品中共分离到114株酵母菌，根据图1和表1的菌落颜色及形态描述与Pallmann等（2001）描述的菌落特征进行对照，将分离得到的114株菌株分为18个不同的菌落类型，如菌株VdF1-M021为细尖假丝酵母（Candida apicola），其菌落奶油色带淡淡的绿色，表面光滑，不透明，单菌落球形突起;菌株VdF1-M026、VdF2-M102、VMH-P013和VSB1-P005为有孢汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiae），其菌落蓝绿色，扁平，表面光滑，不透明，奶油状;菌株VMH-M042、VSB1-M032和VSB2-L076为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其菌落奶油色带绿色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油状。

2. 2 酵母菌26S rDNA D1/D2区序列分析结果

根据酵母菌的26S rDNA D1/D2区序列测序比对结果，可将114株酵母菌菌株划分为18种，选取代表菌株序列（共44株酵母菌）与标准菌株序列构建NJ系统发育树（图2）。结果表明，菌株VSB2-L077、VSB1-M035和VMH-M045与拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）以较高的置信度聚在一个分支上，属于同一个种;菌株VdF1-L059以较高的置信度与双孢接合酵母（Z. bisporus）聚在一个分支上，同属一个种;菌株VMH-M042、VSB1-M032和VSB2-L076与酿酒酵母（S. cerevisiae）聚在一个分支上，应属同一个种;菌株VdF2-P092与佛罗伦萨接合酵母（Z. florentinus）同属一个分支;菌株VSB2-M051与葡萄酒有孢汉生酵母（H. vineae）同属一个种;菌株VdF1-M026、VdF2-M102、VMH-P013和VSB1-P005与仙人掌有孢汉逊酵母（H. opuntiae）同属一个种;菌株VdF2-P093与覆膜孢酵母属亚种（Saccharomycopsis crataegensis）同属一个种;菌株VdF1-L057、VdF2-M098、VSB1-P006和VSB2-P018与接合囊酵母（Zygoascus hellenicus）处于同一个分支，应属于同一个种;菌株VdF1-P002、VSB2-P014和VMH-P010与陆生伊萨酵母（Issatchenkia terricola）聚在同一分支，应属同一个种;菌株VdF2-P086与河内伊萨酵母（I. hanoiensis）为同一个种;菌株VdF1-L063和VdF2-L107与西方毕赤酵母（Pichia occidentalis）同属一个种;菌株VdF2-P090与发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）同处一个分支，但存在一定差异;菌株VSB2-M053、VSB1-P007和VMH-P012、VMH-M047、VdF2-L113与库德里阿兹威氏毕赤酵母（P. kudriavzevii）同属一个种;菌株VdF1-L060与加利福尼亚假丝酵母（Candida californica）同属一个种;菌株VdF1-M020、VdF2-L106、VMH-M041、VSB1-P004和VSB2-L075与盔形毕赤酵母（Pichia galeiformis）同属一个种;菌株VdF1-M021与细尖假丝酵母（C. apicola）同属一个种;VdF1-M031、VdF2-M103、VMH-M044、VSB1-M033和VSB2-M050与泽普林假丝酵母（C. zemplinina）同属一个种;菌株VdF1-M027和VdF2-M100与黏性红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）聚在同一个分支，应属同一个种。

2. 3 不同品种葡萄自然发酵不同时期酵母菌的组成和差异分析结果

2. 3. 1 不同品种葡萄自然发酵酵母菌种类差异

不同品种葡萄自然发酵过程中酵母菌种类有所不同，刺葡萄B发酵过程中分离到的酵母菌种类最多，为11种，包括泽普林假丝酵母、仙人掌有孢汉逊酵母、河内伊萨酵母、西方毕赤酵母、库德里阿兹威氏毕赤酵母、发酵毕赤酵母、盔形毕赤酵母、黏性红酵母、覆膜孢酵母属亚种、接合囊酵母和佛罗伦萨接合酵母。其次是刺葡萄A，分离到10种，分别为细尖假丝酵母、加利福尼亚假丝酵母、泽普林假丝酵母、仙人掌有孢漢逊酵母、西方毕赤酵母、陆生伊萨酵母、盔形毕赤酵母、黏性红酵母、接合囊酵母和双孢接合酵母。夏黑B分离到8种，夏黑A和玫瑰香发酵过程中分离到的酵母菌种类较少，均为7种。

2. 3. 2 不同品种葡萄自然发酵不同时期酵母菌组成差异 从图3可看出，不同品种葡萄自然发酵过程中酵母菌的数量变化具有一定的规律，发酵前期酵母菌数量较少，发酵中期酵母菌数量增多，随着发酵至后期，酵母菌数量又减少。如在刺葡萄A发酵前期、中期和后期，分离得到的酵母菌数量分别为3株、13株和10株;在夏黑A发酵前期、中期和后期，分离得到的酵母菌数量分别为6株、9株和3株。

不同品种葡萄发酵过程中酵母菌组成也具有一定的差异，在发酵前期以非酿酒酵母为主，陆生伊萨酵母出现在刺葡萄A、玫瑰香和夏黑B发酵前期，且所占比例最高，分别达100.00%、50.00%和40.00%，而在夏黑A和刺葡萄B发酵前期未分离到该菌株;在夏黑A、夏黑B、玫瑰香和刺葡萄B发酵前期均分离到库德里阿兹威氏毕赤酵母;盔形毕赤酵母是夏黑A和刺葡萄B发酵前期的优势菌，所占比例分别为33.33%和35.71%。不同品种葡萄自然发酵中期均含有泽普林假丝酵母和盔形毕赤酵母，其中刺葡萄A、玫瑰香和夏黑B发酵中期的优势菌是盔形毕赤酵母，所占比例分别为38.46%、42.86%和28.57%;夏黑A发酵中期的优势菌为酿酒酵母和泽普林假丝酵母，所占比例均为33.33%;刺葡萄B发酵中期的优势菌则有所不同，为西方伊萨酵母，所占比例为30.00%。刺葡萄A、刺葡萄B和夏黑B发酵后期的优势菌均为盔形毕赤酵母，所占比例分别为40.00%、55.56%和71.43%;酿酒酵母在夏黑A、玫瑰香和夏黑B发酵中期开始出现，直到发酵后期，均占有较大比例，分别为66.67%、42.86%和14.29%。但在刺葡萄A和刺葡萄B自然发酵不同阶段均未检测到酿酒酵母。

刺葡萄A和刺葡萄B分别采自福建省明溪县研农生态农业有限公司葡萄园和湖南省芷江县葡萄园，刺葡萄B发酵前期酵母菌种类为9种，刺葡萄A发酵前期酵母菌仅1种;在发酵中期，刺葡萄A和刺葡萄B酵母菌种类分别为6种和7种，优势菌也有所不同，刺葡萄A发酵中期的优势菌为盔形毕赤酵母，刺葡萄B发酵中期的优势菌为西方伊萨酵母;刺葡萄A和刺葡萄B发酵后期酵母菌种类分别为6种和4种，优势菌均为盔形毕赤酵母。夏黑A和夏黑B分别采自福建省明溪县研农生态农业有限公司葡萄园和福建省厦门市海堤葡萄园，发酵前期酵母菌种类均为4种，但优势菌有所不同，夏黑A发酵前期的优势菌为仙人掌有孢汉逊酵母和盔形毕赤酵母，夏黑B发酵前期的优势菌为陆生伊萨酵母;夏黑A和夏黑B发酵中期酵母菌的种类分别为4种和6种，夏黑A发酵中期优势菌为泽普林假丝酵母和酿酒酵母，夏黑B发酵中期优势菌为盔形毕赤酵母;夏黑A和夏黑B发酵后期酵母菌的种类分别为2种和3种，优势菌则分别为酿酒酵母和盔形毕赤酵母。

2. 4 酿酒酵母酿酒性能分析结果

由表2可知，在相同的发酵条件下，从玫瑰香葡萄自然发酵中期分离的酿酒酵母VMH-M042与市售酵母菌RV002和OFC酒精的发酵能力相当，其发酵后的葡萄酒酒精度分别为12.5%、12.2%和12.2%，三者间差异不显著（P>0.05），但均极显著高于市售酵母菌VF和OFG（P<0.01，下同）;酿酒酵母VMH-M042发酵后的葡萄酒总糖含量最低，与市售的酵母菌RV002相当，分别为76.0和76.8 g/L，二者与酵母菌VF、OFG和OFC存在极显著差异;酿酒酵母VMH-M042发酵后的葡萄酒还原糖含量最高，为40.5 g/L，与酵母菌VF和OFC存在显著差异（P<0.05），与酵母菌RV002和OFG存在极显著差异;在总酸方面，酿酒酵母菌VMH-M042发酵后的葡萄酒总酸含量较高，为5.6%，与酵母菌OFC相当，与酵母菌RV002、VF和OFG存在极显著差异。以上理化指标初步表明，酿酒酵母VMH-M042更适合本地葡萄酒的酿制。

3 讨论

葡萄酵母菌的数量和多样性受葡萄品种、成熟度、气候条件、地理位置、机械损伤和病虫害防治强度等因素的影响（Raspor et al.，2006）。本研究结合纯培养法和26S rDNA D1/D2区序列分析法，对福建地区不同品种葡萄自然发酵不同阶段酵母菌多样性进行分析，结果表明，不同品种葡萄自然发酵过程中共分离获得114株酵母菌菌株，经WL培养基的形态鉴定和26S rDNA D1/D2区序列分析，114株酵母菌菌株可分为18个种，包括拜耳接合酵母、双孢接合酵母、酿酒酵母、佛罗伦萨接合酵母、葡萄酒有孢汉生酵母、仙人掌有孢汉逊酵母、覆膜孢酵母属亚种、接合囊酵母、陆生伊萨酵母、河内伊萨酵母、西方毕赤酵母、发酵毕赤酵母、库德里阿兹威氏毕赤酵母、加利福尼亚假丝酵母、盔形毕赤酵母、细尖假丝酵母、泽普林假丝酵母和黏性红酵母。其中，泽普林假丝酵母、发酵毕赤酵母、仙人掌有孢汉逊酵母、加利福尼亞假丝酵母、葡萄酒有孢汉生酵母、拜耳接合酵母、酿酒酵母、陆生伊萨酵母、覆膜孢酵母属亚种、黏性红酵母和库德里阿兹威氏毕赤酵母等在相关文献中报道较多（Csoma and Sipiczki，2008;Berradre et al.，2012;Bezerra-Bussoli et al.，2013;杨莹等，2016;杨宽等，2018）。同前人研究相比较，本研究首次分离到4种酵母菌，分别为盔状毕赤酵母、西方毕赤酵母、河内伊萨酵母和细尖假丝酵母。葡萄发酵过程中菌群的变化受葡萄产地气候、葡萄浆果成熟度、葡萄园管理状况和发酵工艺水平等各种因素的影响（Guillamón et al.，1998;许维娜等，2019）。本研究从福建刺葡萄和主要栽培葡萄品种中分离得到的酵母菌资源丰富，特异性酵母菌资源较多，与福建省属亚热带湿润季风气候有很大关系，酵母菌在长期的环境适应中形成了独具地域特色的酵母菌菌群;同时，由于不同葡萄品种富集的自然酵母菌群在种类和数量上存在明显差异，且在葡萄自然发酵过程中随糖分下降和酒精度不断升高，酵母菌群此消彼长，就形成了葡萄自然发酵过程中酵母菌群变化的差异。

研究表明，自然发酵前期酵母种类相对较复杂，且大多为非酿酒酵母菌（刘树文等，2008），在发酵中后期，随着糖的降低和酒精度的进一步升高，有些酒精耐性较差的非酿酒酵母逐渐消亡，酒精耐性较高的酿酒酵母逐渐占据优势（Maro et al.，2007;刘树文等，2008）。王泽举等（2008）在新疆葡萄酒自然发酵初期分离得到8个属的酵母菌，随着发酵时间的延长，酒精度升高，东方伊萨酵母和假丝酵母等酒精耐性较差的菌株逐渐消亡，酒精耐性较强的酿酒酵母逐渐占据优势并最终完成发酵。本研究与其相似，在不同品种葡萄发酵初期可分离到陆生伊萨酵母、仙人掌有孢汉逊酵母、库德里阿兹威氏毕赤酵母、接合囊酵母和盔形毕赤酵母等非酿酒酵母。在夏黑A、玫瑰香和夏黑B发酵中期开始分离到酿酒酵母，直到发酵后期，均占有较大比例，分别为66.67%、42.86%和14.29%。王凤梅和马利兵（2016）也发现在内蒙古西部赤霞珠葡萄自然发酵初期，葡萄汁有孢汉逊酵母和克鲁维毕赤氏酵母的数量占据优势，随着发酵进行，非酿酒酵母菌株数量有所减少，酿酒酵母数量逐渐增加，至发酵后期，发酵液中仅检测到酿酒酵母的存在。本研究还发现，在刺葡萄A和刺葡萄B的自然发酵整个过程中未分离到酿酒酵母，目前关于刺葡萄果皮和自然发酵过程中酿酒酵母分离相关的报道较少，因此，后续研究将对其发酵过程中未产生酿酒酵母的原因进行深入探究。

葡萄品种、酿造工艺及发酵过程中酵母菌的代谢是影响葡萄酒风味的主要因素（韩北忠等，2007）。在葡萄酒发酵过程中，酵母作为主要的发酵微生物对葡萄酒产量、质量和风味影响很大，不同葡萄产区本土酵母适宜当地的土壤、气候和葡萄品种，具有独特的代谢特性，有助于生产出与众不同的本土地方特色葡萄酒（刘爱国等，2008）。因此，传统葡萄酿酒园区酿出的美酒与商业化相比，具有很强的产区风格和地方特性（王慧等，2008）。从南摩拉维亚葡萄酒产区长相思、黑皮诺葡萄浆果上和自然发酵的葡萄汁中筛选出一些有代表性的菌株，与商业酵母BS6进行发酵性能比较，发现其本地区域特色更浓郁（?uranská et al.，2016）。在对福建葡萄酵母菌分离和收集整理后，发现3株酿酒酵母菌株（VMH-M042、VSB1-M032和VSB2-L076）26S rDNA D1/D2区序列相同，选取VMH-M042酿酒酵母对其酿酒特性进行初步分析，结果表明，在相同的发酵条件下，酿酒酵母VMH-M042的酿酒性能（酒精度、总糖、还原糖和总酸）优于市售酵母菌RV002、OFC、VF和OFC，因此，该酿酒酵母在本地葡萄酒生产方面可能具有更强的优势和应用价值。Liu等（2015）从新疆鄯善地区筛选的7株本土酵母菌比商业酵母菌F15可产生更多的酯类物质，因此其感官评价最高。Senses-Ergul和Ozbas（2016）在安那托利亚葡萄自然发酵过程中也筛选到4株各项性能比较优良的酵母菌株。本研究从福建本地筛选分离的酵母菌发酵性能、代谢水平和香气成分等还有待进一步分析，以期为生产出具有显著福建特色的葡萄酒提供良好的菌种来源。

4 结论

福建地区不同品种葡萄分离得到的酵母菌资源丰富，区域性差异明显，特异性资源较多;其中酿酒酵母VMH-M042在葡萄酒发酵中表现出较优良的酿酒性能，该研究可为福建地区乃至南方葡萄酒酿制提供丰富的菌种资源和理论依据。

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（責任编辑 罗 丽）